Bettertransformationefficiencieswithrestrictionsysteminhibition
- IncreasetheinsertionefficiencyofEZ-Tn5™Transposome™complexes.
- EnhancethetransformationefficiencyofunmodifiedDNAbyblockingtypeIR-Msystems,whicharewidespreadinEubacteriaandArchaebacteria.
Applications
- IncreasethetransformationefficiencyofunmodifiedDNA2byblockingtypeIR-Msystems,whicharewidespreadinEubacteriaandArchaebacteria.3
- IncreasetheinsertionefficiencyofEZ-Tn5™Transposome™complexes.2
DNAtransformationcanbedifficulttoachieveinmanybacterialstrainsduetothepresenceofoneormorerestrictionandmodification(R-M)systemsthatcleaveunmodifiedDNAthatisrecognizedas"foreign."TypeOne™RestrictionInhibitor*providesapowerfulmethodforincreasingtransformationefficienciesinbacterialstrainswithtypeIR-Msystems.Developedasauniquepreparationofaphageproteincalledocr,1TypeOneInhibitorisreADIlyelectroporatedintocellsalongwithtransformingDNA.Invivo,theproteinactsasamoleculardecoythatblockstheDNA-bindingsiteoftypeIR-MenzymesandinhibitsDNAcleavage.
Benefits
- Easytouse:SimplyaddTypeOneRestrictionInhibitortounmodifiedDNAoraTransposomeandelectroporateusingstandardmethods.
- BlocksallknownfamiliesoftypeIR-Menzymes1andcanthereforebeusedtoincreasetransformationefficienciesinavarietyofbacterialcells.
Table1.EffectofTypeOne™RestrictionInhibitorontransformationefficiencies.
Strain(TypeIR-Msystem) | TypeOne™ Inhibitor | TypeofDNAorTransposome™ | Recombinants perµgDNA |
S.typhimuriumLT2(StyLTIII) | pUC19(100pg) | 3.0×106 | |
S.typhimuriumLT2(StyLTIII) | X | pUC19(100pg) | 3.0×108 |
E.coliMG1655(EcoK1) | 48kbfosmid(50ng) | 3.0×103 | |
E.coliMG1655(EcoK1) | X | 48kbfosmid(50ng) | 1.4×106 |
S.typhimuriumLT2(StyLTIII) | EZ-Tn5™<R6Kγori/KAN-2>TnpTransposome™(1µl) | 1.3×104 | |
S.typhimuriumLT2(StyLTIII) | X | EZ-Tn5™<R6Kγori/KAN-2>TnpTransposome™(1µl) | 1.0×106 |
References
- Walkinshaw,M.D.etal.(2002)Molec.Cell9,187.
- Hoffman,L.etal.(2002)EpicentreForum9(2),8.
- Murray,N.E.etal.(2000)Microbial.Molec.Biol.Rev.64,412.
*Coveredbyissuedand/orpendingpatents,exclusivelylicensedorassignedtoEpicentre®(anIllumina®Company).
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内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁(cellwall)上的特有成分,主要是脂多糖中的类脂A,在细菌被裂解时被释放出来,由于其化学结构和特性,在质粒的纯化过程中很容易混入质粒DNA一同提取出来。内毒素的存在会严重的影响质粒转染细胞的效率,此外会激活造血细胞(如B细胞、巨噬细胞等)的非特异免疫反应,造成实验的假阳性,所以转染级质粒的提取纯化必须去除内毒素。
EntransterTM-R4000是英格恩生物(EngreenBiosystem)最新研发合成的针对siRNA、microRNA、mimic、inhibitor、mRNA和shRNA等RNA的转染试剂。EntransterTM-R4000不仅可以转染小RNA,而且针对mRNA等长链RNA优化。由于纳米技术的应用,EntransterTM-R4000能做到高达90%的转染效率和60-90%的沉默效率,对难转染细胞和原代细胞也非常适用。
先附上一篇英格恩生物RNA转染试剂转染mir-346至Jurkat细胞研究甲状腺的文献,以供参考。
RNA转染试剂转染Mir-346至Jurkat细胞研究甲状腺.pdf(5947.72k)
但是在选择的时候,也需要注意其他的一些问题。
1、采用何种原料和抗体,是否高效、灵敏、特异
2、规范包被操作,吸附是否均匀
3、重复性、可靠性
6、是否提供技术服务
7、适用于血浆、血清、组织匀浆液、细胞培养上清液、尿液等多种类型的样本
8、可检测动物类型是否丰富
9、可检测指标是否齐全
elisa试剂盒就查下博欧特生物
使用方法:
1、 血清:操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后,1000×g离心10分钟将血红细胞迅速小心地分离。
2、 血浆:EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。
3、 细胞上清液:1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4、 组织匀浆:将组织加入适量生理盐水捣碎。1000×g离心10分钟,取上清液。
5、 保存:如果样品不立即使用,应将其分成小部分-70℃保存,避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒,检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
DXY721认为:
悬浮细胞和贴壁细胞在转染过程中差别不大,主要差别在于转染后的筛选,当然如果你做的是瞬时转染就不存在筛选的问题了。
其实转染的过程很简单,问题是能不能转的进去的,转染率能有多少,转进去是否可以稳定表达目的蛋白等等。
我们也是用脂质体做悬浮细胞的转染,说明书上都有具体的操作过程,将脂质体和目的基因按比例混合,然后加到细胞悬液里就OK了,说的简单,实际上还是有一些细节要注意的,比如脂质体和目的基因混合的比例,转染的细胞数,细胞的代数,细胞的状态,有的还要求在转染的前一天传代一次,不过不要怕,这些在脂质体说明书上都有明确的说明,按照说明书做就可以了。
jinghuanlv认为:
悬浮细胞和贴壁细胞转染还是有很大不同的。
脂质体转染的原理基于电荷吸引原理,先形成脂质体-DNA复合物,散布在细胞周围,然后通过细胞的内吞作用,将目的基因导入细胞内,而脂质体复合物与贴壁细胞的接触机会比悬浮细胞高出很多倍,所以,脂质体转染时悬浮细胞的转染效率要明显低于贴壁细胞。
我们实验室转染悬浮细胞是用的电穿孔法,目前为止,悬浮细胞转染的最好方法还是电转,我们实验室用的电转仪是Bio-Rad的,使用条件是电压250V,电容975uF,效果不错,不妨一用。