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在科学研究中细胞培养等技术已是相当成熟,可对细胞的状态完全无保留的呈现给研究者是一直以来的难点。不过,现在一种新的成像技术的出现,给研究者们带来了曙光,那就是全息成像技术,前期这种技术大多应用在摄影方面,目前瑞典Phiab公司采用这种全息技术新开发出HoloMonitorTMM4激光全息成像及分析系统,成功将这种高新技术应用到生命科学领域。
那这位新晋之主能为我们带来哪些惊喜呢?
1,长期、非侵入性细胞检测
M4是采用物理干涉成像技术,实现了对细胞非侵入、无标记性的观察,最大程度地体现细胞的真实状态,并可以排除实验处理的假阳性。在系统的分析软件中,可以对观察细胞实现3D重建,并对图片添加伪彩,增加细胞与背景的对比度,让你实验图片焕然多彩,不再只是黑或白。
2,细胞追踪
M4可以对细胞进行长时间延时拍摄,实现细胞边培养边拍摄,自动记录细胞的运动性。目前在许多科学研究中,细胞运动性,细胞迁移率是判断细胞敏感性的重要指标,在M4系统中不仅可以获得细胞长时间的形态上的直观图片,同时,分析软件中的Trackcells可以给予单细胞,多细胞的运动轨迹,迁移方向,迁移距离等多种数据,避免了你在实验之后的数据统计和数据分析过程,真可谓是省时省力。
3,数量统计
M4分析系统中采用细胞分割识别的方法,可以进行多种统计方法的细胞识别。(也可以进行手动调节哦!)根据采集图像区域与培养皿体积的相关性,对整个培养皿的细胞数量进行统计。除此之外,系统会自动生成任一细胞参数的数量统计柱形图,比如细胞体积的柱状图即不同细胞体积下的细胞数量分布。
4,形态学分析
形态学分析是M4系统中相当强大的功能。无论是实时成像还是延时成像,对图片中每个细胞的各个形态参数都有记录,如:体积、面积、最大厚度、平均厚度、周长、不规则度等。软件中Analyzecell可以对细胞参数之间的相互关系及细胞的分布情况直接输出散点图,研究者同时可以对散点图进行标记,记录实验所需的实验分析区域。并对每个区域又仅进行细胞形态学及统计学分析。该功能对细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期等领域有很好的应用。
5,数据输出
M4不仅可以输出图片也可以对延时拍摄图片制作成视频进行输出,更加直观的对细胞形态及细胞活动进行观察,为你的科研汇报更添佐证。
HoloMonitorTMM4激光全息成像及分析系统利用全息技术将细胞的每个点都几录下来,每个全息图中包含了图像中的全部数据,对于科研要求越来越严格的研究人员来讲,这无疑是细胞生物学的一个新的里程碑。
HoloMonitorTMM4激光全息成像及分析系统已经应用到了许多生命科学研究方面,如肿瘤侵袭与转移、细胞耐药性、纳米微阵列、混合纳米聚合物胶束、细胞周期、细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、神经细胞观察等。目前研究者仍在挖掘M4的更多技术,更多应用、更多创新。
酶切体系(参考):
质粒17ul
buffer2ul
酶1ul
----------37度,过夜。
酶切位点
在质粒上,所选的两个酶的酶切位点不可以靠的太近,如6bp
建议载体质粒不要用双酶切,用两次单酶切之后切胶回收.另外建议加多以下两个个步骤:
1.PCR产物的酶切片断做TA克隆,之后再酶切回收,与载体相连.
2.目的片段与载体连接之后建议先转化DH5α这些容易转化的菌株.然后筛选到的阳性克隆测序之后,提质粒,用质粒转化BL21,转化率很高.质粒不一定要新鲜提取,我的质粒放在-20度冻了大半年,作为载体完全没问题,只要确定不降解.
酶切的量、小提的质粒浓度和纯度
浓度:
根据我的实验,OD值0.5左右吧,不一定很准确。260:280通常是1.8左右。3ml菌过夜,进行小提,并没有对OD限定.小提的效果好不好主要决定于你的溶液I,II,III的质量以及你的操作手法,
特别是加溶液II时最为关键。现在有很多试剂盒既便宜效果又好,条件允许的话可以考虑购买。
琼脂糖电泳目测,不一定测OD,连接比例更重要.
质粒表达载体不用测序的,通常都是跑电泳看一下质量,然后再根据图谱选择适当的酶,看能不能够切开,如果能够切开,基本上就可以采用了。
纯度:
酶切对质粒的纯度要求高,如果蛋白和RNA去的不干净会影响酶切;
我们用于酶切的质粒的ratio值一般在1.8左右。
酶量;
在量上最好不超过酶的酶切能力,一般酶都为10U/ul,就是说酶切体系里加
1ul的酶可以在合适的温度下,1小时内消化10ugDNA,但在实际操作当中
一般酶都是过量的,而且延长了酶的作用时间,比如作用6小时。
因为酶切产物用于连接,所以我们酶切时质粒的用量尽量多,用20ul的体系
时可以如下加样,我们也有用50ul的体系切过。
回收目的片段与阳标一起进行酶切:
PCR后,电泳回收目的片断(比如玻璃奶或者一次性回收柱回收),再进行酶切。除非产物非常特异,直接酶切PCR产物效果有时不是很好,还有一般PCR体系里过量得dNTPs会影响酶切效果。酶切后,可以用标准得乙醇沉淀法沉淀酶切产物,获得高纯度得酶切产物,也即是你的黏性目断片断供后边得试验。而DNA的纯度对酶切效果是有很大的影响的。而酶切时应加个阳标(如含相应酶切位点的质粒载体)来确定酶和酶切体系是不是work的。如果这两步没问题,你的酶切肯定能顺利的。如果有阳标一起来切,容易找出问题的所在。
酶切不下
酶切这一步,本来问题不大,你严格按说明书上的要求进行就行了,包括酶量,酶切体系以及DNA的量也要按要求加入。而DNA的纯度和浓度是有必要测定的,最好OD260/280要接近2.0。DNA的量过大或是纯度太低都会影响酶切效果。万一如果无法充分酶切,但有所需要的片段,就可以根据Markers的位置回收所需片段。
因为基因组大部分是甲基化的,酶切不下来的原因一可能是内切酶活性低,或者是基因组杂质含量较高,或者盐离子浓度太高(不同的酶有不同的盐浓度).还有就是基因组酶切酶的量要求比较多,大概1ugDNA/10u酶,如果不行还可以加大量,酶量不能超过酶切体系的1/10,浓度过高里面的甘油会影响酶的活性。接头5-端是去磷酸化的,这样就可以避免接头自连,pcr结果就会有东西出来。
连接酶反应温度
空掉开低一点,一般16度连接2-3小时;
放进4度冰箱中,连接过夜,16小时
多片段连接:
将三个片断放在一起连的,效果的确不好.还是应该一个一个地连接.
连接比例
我用T载体连接PCR产物,请问片段和载体的摩尔比怎么选择连接效率好?根据什么因素来调节?有没有经验值?
一般片段:载体=3~8:1。根据片段的大小、连接时间、温度、感受态细胞等因素来调节。经验值就是3~8:1。4度连接过夜,用新鲜制备的感受态细胞,一般可以得到很好的克隆效率。
补充一句:如果PCR产物片段比较大(>1kb)的话一般用3:1的比例,如果比较小就几百bp的话用>3:1的比例连接效率能高一些。3-10:1一般没问题.
建议仔细参看Teasy的说明书
接头处理
接头的处理和连接这一步其实是挺头疼的。建议先制备和接头两粘端连接的线性质粒分子。因为这对于你接头是否完成了磷酸化和退火处理提供了一个评价体系。你接头处理完,并通过评价,你就可以放心用了。退火时的处理一般要使用专门的annealingbuffer,否则效果不好。而对于粘端连接来说,应该问题不大,唯一担心的是能进行连接的片段太少了,影响下面的PCR扩增,所以酶切这一步是很关键的。
最后一步是高保真PCR,首先建议用Taq酶进行扩增,然后再用Pfu酶扩增,因为后者效率比较低。其实你用Taq酶如果扩出来,测序经blast/n后,如果有突变,你也完全可以根据正确的序列重新设计引物将之调出来。
注意感受态
如果还是不行,建议检查一下感受态菌的质量。
我的感觉是感受态很重要,你可以转化连接产物的同时用纯质粒转化进行感受态活性的验证,后者取1ul转化,10ul涂板,好的感受态一般要长50个菌落以上。其次是连接体系,目的片断与载体的摩尔比为3-10:1,除此,连接酶也很重要,最好不要使用储存太久的酶,建议你下次做的时候用别人的酶试一下。
转化要用空质粒作对照,保证感受态没问题,细菌一般长12到16小时就形成可见的菌落,转化后的菌落一般比为转化的菌落小一些。
使用了一下,发现很有用
对于查找文献中引物的位置
只要输入正义引物和反义引物,选择物种
就能预测pcr结果
可惜不能预测rt-pcr(因为数据库里没有mrna的数据)
大家以为如何,怎么这版没人提起过呢
谁知道哪里能预测rt-pcr结果呢
大约50M
《数字化卒中单元管理系统》单机试用版
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用户名:ttyy_dsu
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单机试用版版为免费
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正式单机版1万元
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1.按照提示进行安装,最好不要改变软件默认的安装目录。安装过程中提示需要密码,你可以填写任何密码。
2.在“C:ProgramFilestyy数字化卒中单元管理系统数字化卒中单元管理系统”内找到“DSU.exe”,创建快捷方式。
3.第一次登陆系统,用户名为:admin密码:123,然后以管理员身份添加不同工作人员,以便于行使不同的职责。
4.检查报告仍然以“北京天坛医院神经内科”为表头,这也是保护版权的一种办法,请大家谅解。
5.试用版本可以添加96名患者,如果超过,试用期结束。如还需要本软件,请于天坛医院神经内科联系,mailto:yzh@bjtth.com。
6.试用版本数据储存于安装目录下的dsu.mdb文件内,如果以后想安装网络版本,试用期内的患者资料不能进入网络版的数据库。
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5。不同的用户只能进行自己责任的操作,而对于其他职能的工作你只能看到,不能修改。
软件为原创、独家,申请加5分,请各位朋友们支持!
卒中单元数字化管理系统.ppt(122.0k)
试纸条:简单、快速,但对于深加工食品不适用
普通聚合酶链式反应(PCR):准确度较高,灵敏度高,价格低,缺点是专业性要求高,电泳的染料对人体有害,只能检测一个指标
实时荧光定量PCR:灵敏度高、准确度高、高通量、可实时监控,可定量判断、自动化程度高,缺点是仪器价格高昂、操作复杂、配套产品少、维护费用高
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数字PCR:准确度高、重现性好、可绝对定量、检测通量高、灵敏度好,但仪器价格昂贵
数字PCR基本原理如下:
想请教大神们,怎样设计INT引物、MB-red探针以及MB-green探针?

