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Promega/TNT® T7 Quick for PCR DNA/1kit/L5540
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Promega/TNT® T7 Quick for PCR DNA/1kit/L5540
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  2013年8月9日-10日,国际分子诊断产业高峰论坛在武汉光明万丽酒店举行,公司负责人周主任作为公司代表,参加了论坛会议。作为分子诊断产业的第一战略峰会,该论坛邀请了罗氏、雅培、凯杰、华大、Illumina,LlifeTech等行业领衔者聚集会场,大会就分子诊断产业现状及政策解析、基因诊断和分型在个体化医疗中的应用、分子癌变与癌变早期检测、核酸质谱Massarray分析技术在分子诊断中的应用、仪器企业与试剂企业的发展、基因测序技术在... 查看更多>
靶向化药物和个性化治疗的发展和应用,是当代医学发展的主要潮流和方向,尤其是在恶性肿瘤、自身免疫、心脑血 查看更多>
提供商:卓灏医药 查看更多>
会议介绍中国生物物理学会临床分子诊断分会、中国遗传学会遗传诊断分会在2018年11月16-17日主办了"第一届中国临床分子诊断大会",会议的主题为“创新与转化”,将针对临床分子诊断面临的机遇和挑战,邀请基础研究、临床医学、实验诊断等领域院士、专家,对分子标志物的发现、分子诊断新技术的研发及其在临床各领域的应用等进行广泛的学术交流。近年来,随着生物技术的快速发展,各类组学技术层出不穷,新的分子标... 查看更多>
2021-09-06
数字PCR即Digital PCR(dPCR),它是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR,数字PCR可让你能够直接数出DNA分子的个数,是对起始样品的绝对定量。... 查看更多>
MERS 病毒(中东呼吸综合征冠状病毒)是一种类似SARS的新型冠状病毒,它通过亲密接触传播,可以人传人。自2012年9月被确认起,截止2015年5月31日全球大概有1146个感染 MERS 病毒的病例,死亡率高达40%。据报道,韩国二次感染者已增至18人。日前,国家卫生和计划生育委员会通报,广东省惠州市出现首例输入性中东呼吸综合征确诊病例。 Bioneer公司是韩国最大的分子诊断试剂生产厂家,KOSDAQ上市公司。专注于各种流行... 查看更多>
“2015(第三届)分子诊断产业高峰论坛”于10月16-17日在成都隆重举行,此次会议焦点为“覆盖分子诊断,了解行业新趋势;聚焦基因检测,挖掘市场新蓝海”,来自分子诊断领域的200余位专家代表参加了此次盛会。     全式金生物(TransGen Biotech)作为国内领先的分子、细胞生物学试剂生产厂家,在会场NO.1展台设展。现场为大家展示和介绍蛋白提取试剂盒、42-65℃高温反转录试剂盒、全封闭热启动Taq酶、新型高灵敏qPC... 查看更多>
西安天隆科技有限公司是一家以市场为先导、产学研科技研发为基础、追求自主品牌的创新驱动型高科技企业,公司针对医学诊断、食品安全、病原体检测和生物学医学科研等市场需求,一直专注分子诊断、核酸检测、POCT等检验仪器、医疗器械及体外诊断试剂的研发、生产和销售。 查看更多>
在论坛上看到不停地有人在问RT-PCR的问题,实际上在以前的帖子中各位香主和eeflying(我为什么总是提他们?因为还是很佩服的哦,生怕自己说错了,被他们指出来哦)都谈到了很多,鄙人也充大头答了一些问题,但是还是有各种问题,由于的基因表达还有点实战经验(但也技止此而),所以想些点东西 查看更多>
申请单位:江苏省种子管理站设备名称:数字PCR仪专家论证意见:采购单位提出的上述需求属实,目前国内产品无法满足以上技术功能要求,进口仪器在功能配置、检测精度、稳定性和工作效率等方面更为先进。该仪器的采购可以有效提升申请单位分子检测水平,且上述产品不属于国家法律法规政策明确规定限制进口产品,为此建议采购进口设备。联系人:杨华联系电话:025-86203659公示日期:2017-12-14附件: 数字PCR.pdf  查看更多>
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http://www.genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr

使用了一下,发现很有用
对于查找文献中引物的位置
只要输入正义引物和反义引物,选择物种
就能预测pcr结果
可惜不能预测rt-pcr(因为数据库里没有mrna的数据)

大家以为如何,怎么这版没人提起过呢

谁知道哪里能预测rt-pcr结果呢
在定量PCR时,我们常常纠结一个问题,究竟是相对定量还是绝对定量呢?如今,你无需纠结了,因为数字PCR(digital PCR)来了。尽管这两种技术有些类似,都是估计起始样品中的核酸量,但它们有一个重要的区别。定量PCR是依靠标准曲线或参照基因来测定核酸量,而数字PCR则让你能够直接数出DNA分子的个数,是对起始样品的绝对定量。因此特别适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域:拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究(如等位基因不平衡表达)、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。
无法作答
色谱分析做系统适用性试验主要是为了确定分析使用的色谱系统是有效的、适用的。系统适用性通常用四个参数来确定系统的适用性:分离度、柱效、重复性和拖尾因子。  其中分离度和柱效是二个最重要、也更具有实用意义的参数。分离度是判断两物质在一个方法中分离的程度,虽然与柱效相关,但在衡量系统适用性时,首先强调的应该是分离度,只有当色谱图中仅有一个色谱峰或测定微量成分时,规定柱效才有其特殊重要性。重复性和拖尾因子,分别对重现性和色谱峰的峰形做出了要求。重现性保证了方法的可重复性,对柱效能提出了要求,柱子老化、塌陷,拖尾因子则难以达到要求数字PCR 和色谱分析系统及中高压层析系统提醒你:色谱分析以分离出来时间位置来判断是何种物质,以峰的积分面积来分析其含量。色谱分析法,又称层析法。根据其分离原理,有吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱与排阻色谱等方法。 ---即是一种分析方法色谱分析系统,是基于色谱分析法的一种分析仪器,如:液相色谱、气相色谱、离子色谱、凝胶色谱等。
数字PCR介绍_核酸123
猫猫7m_3852021-07-27
在定量PCR时,我们常常纠结一个问题,究竟是相对定量还是绝对定量呢?如今,你无需纠结了,因为数字PCR(digital PCR)来了。尽管这两种技术有些类似,都是估计起始样品中的核酸量,但它们有一个重要的区别。定量PCR是依靠标准曲线或参照基因来测定核酸量,而数字PCR则让你能够直接数出DNA分子的个数,是对起始样品的绝对定量。因此特别适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域:拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究(如等位基因不平衡表达)、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。向左转|向右转
可能是不是机器没信号造成的啊,我看你这个情况很像,建议楼主查找下说明书,按照说明书来具体操作呢

请教有没有人知道哪里可以做数字PCR(dd-PCR)的公司,急求!

跪谢!


相关疾病:脑血管疾病【下载】《数字化卒中单元管理系统》单机试用版
大约50M

《数字化卒中单元管理系统》单机试用版
下载地址:
http://mail.163.com
用户名:ttyy_dsu
密码:123456

单机试用版版为免费
单机试用版光盘版收取一定材料费
正式单机版1万元
正是网络版5万元
联系电话:67050318或67050281

《数字化卒中单元管理系统》单机试用版本
1.按照提示进行安装,最好不要改变软件默认的安装目录。安装过程中提示需要密码,你可以填写任何密码。
2.在“C:ProgramFilestyy数字化卒中单元管理系统数字化卒中单元管理系统”内找到“DSU.exe”,创建快捷方式。
3.第一次登陆系统,用户名为:admin密码:123,然后以管理员身份添加不同工作人员,以便于行使不同的职责。
4.检查报告仍然以“北京天坛医院神经内科”为表头,这也是保护版权的一种办法,请大家谅解。
5.试用版本可以添加96名患者,如果超过,试用期结束。如还需要本软件,请于天坛医院神经内科联系,mailto:yzh@bjtth.com。
6.试用版本数据储存于安装目录下的dsu.mdb文件内,如果以后想安装网络版本,试用期内的患者资料不能进入网络版的数据库。
7.《天坛国际脑血管病会议》以后,很多朋友对本软件产生兴趣,在不到一周的时间内,作者完成了单机试用版,该版本没有经过长时间调试,可能会存在一定的漏洞,如果发现请按照以上的邮箱地址发信给我。
现在申请上传:《数字化卒中单元管理系统》单机试用版

1。第一次使用的时候,首先以用户名:admin密码:123登陆
2。然后看到主界面-帮助-增加用户
3。添加新用户:语言师、康复师、心理师、主管医生、责任护士等
4。然后以责任护士的身份从新进入程序:看到主界面-操作-卒中登记,添加新患者,这样就可以在患者列表中看到患者名字
5。不同的用户只能进行自己责任的操作,而对于其他职能的工作你只能看到,不能修改。

软件为原创、独家,申请加5分,请各位朋友们支持!

卒中单元数字化管理系统.ppt(122.0k)
常规PCR一般注意点:
1)PCR模板是关键,引物可以优化。制备模板的时候,一定要注意核酸模板的纯度和量。纯度上要避免杂质和杂蛋白质的混入,同时还要注意添加模板的量,模板很理想的话,不用加太多,加的多了,混进去的杂质机会就多了。当模板的浓度过低,比如低于100个分子时,引物和模板之间就很难发生反应.引物容易自身进行反应形成二聚体.用boosterPCR,即开始几个cycles保持primer的低浓度,保证primer:template的molarratio在107~108.以确保开始扩增的准确性.然后boostePrimer的浓度到正常的水平

2)退火温度是从55度开始.根据情况配合以Mg离子浓度进行调整.有条件的可以做grADIentpcr.退火的时间在30-60S,时间短一些可以得到更好的效果.

3)首先是你的TAQ酶要在冰上操作,以免失活(Taq酶容易失活所以冬天最容易出结果),TAQ酶使用时最好分装。再就是你的引物以及DNTP和模板操作完后一定放进冰箱,注意不要污染,PCR完成后要及时从PCR仪取出(如果你的PCR仪没有保温功能),如果你放在外面时间较长可以放-20度冰箱(尤其片段比较小时)。TAQ酶一般比较稳定,按照一般的惯例,分子生物学的东西从转运到加样,全部要在冰上操作
要注意的是,DMSO,GLYCEROL等会抑制polymerase的活性,所以需要scouting出最适的浓度.可以加入一些nonionic试剂,如Tween,Nonid,Trition之类的反过来抑制SDS.还有proteinaseK也要除干净,不然会降解polymerase.
一些高保真没的效率要远远低于Taqpolymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些.另外,一般的情况下,变性的温度可以使用90~92度,变性的时间也可以缩短,

4)Mg离子的作用主要是dNTP-Mg与核酸骨架相互作用并能影响Polymerase的活性,一般的情况下Mg的浓度在0.5-5mM之间调整,同样要记住的是在调整了dNTPs的浓度后要相应的调整Mg离子的浓度

PCR实验中出现的问题及对策:
一、非特异性条带
原因:1>引物特异性差2>模板、引物↑;3>酶过量;4>Mg离子浓度↑;5>Tm↓;6>循环次数太多;7>被基因组DNA污染
对策:1>重设引物;2>引物、模板↓;3>减少酶量;4>Mg浓度;5>Tm适当;6>减少循环次数7>重新处理样品
具体措施:
1、Primer浓度过高,建议以0.1uM间隔递减
2、酶量过多,建议0.5U间隔递减
3、循环次数过多,建议2个循环间隔递减
4、Anneal温度过低,以1度间隔递增。不迷信文献上所谓的退火温度。摸下梯度,范围应该是Tm-10和Tm+5。一般选Tm值低5度的温度开始摸条件,很难摸出时可以使用降落PCR,普通的9600PCR仪也可以做,只是程序麻烦些。对于20个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。
5、采用Hotstart法或Coolstart法,减少从室温上升到变性温度过程中引起的Primer非特异性Annealing。简易热启动的方法是加样时最好在冰上加,当然可以做个简易冰盒,直接在94度放入样本到机器,效果不错。
6、Template量过多,Template量以20%递减。PCR模板是关键,引物可以优化。制备模板的时候,一定要注意核酸模板的纯度和量。纯度上要避免杂质和杂蛋白质的混入,同时还要注意添加模板的量,模板很理想的话,不用加太多,加的多了,混进去的杂质机会就多了。
7、Extension时间过短,30s间隔递增。
二、带微弱
1.出现的现象:扩增带时有时无,出现时与国外文献中的照片相似,不出现是则看不到或者非常弱。
2.曾用的解决方法:换过PCR中所用的试剂。甚至想到引物之间可能有二聚体等影响结果(虽然文献中及自己的实验中有时能出现很好的结果,但实在是万般无奈),把各引物单独或者两两结合进行试验,时好是坏。
3.思考:第一点,是否是管子的问题?管子的质量不是很好(为了便宜),特别是外形不是很规矩,与扩增仪上的管孔结合不紧密,又不经常加油,而原装管子则与管孔结合较紧密。是否由于此而使管内温度与实际设定温度不符呢?第二点,那么是否是变性温度较高使酶过早的失活?虽然扩增的产物很弱,但分子量是相符的,说明扩增在进行,只是产物量较少,这可能与Taq酶的活性有关.
4.最后解决:将变性温度由文献的95℃改为94℃,问题解决。以后各次扩增均得到满意的结果。
三、设立对照
设立阴性对照检测是否被基因组DNA污染。如果阴性对照的PCR结果也显示同样条带,则需要用重新处理样品。
设立阳性对照可以检测是否模板CDNA及引物有问题。
空白对照:加的是“水”——出现“区带”
待检样品:加的是“模板”——无“带”
说明:1,水被污染
2,模板阴性
四、遇到意外继续实验
PCR体系遇到停电就放在4度1天,还可以扩出来,意外时不要扔还可以做一次啊

PCR操作注意点
1、写好试剂标签
1)对于需要存放的试剂、样品,都有明确的标签,套小的密实袋,离心管上有品名、浓度、日期,在密实袋上会重复写一次;
2)实验记录上还会记下新来试剂的存放日期;
3)用成品试剂盒时,除了会在实验记录上记下某日用量多少,还会在试剂盒盖内侧标明某日用量。

2、管子放置
做大批量PCR用八连管,八连管的盖子有一端有缺口,有缺口的那段向着自己,有时碰到盖好后没有拿稳掉下来,也能准确无误的分清楚前后次序。

3、准备工作
实验之前,试剂器皿仪器都准备妥当,且在脑海中将实验目的和步骤联系起来再进行一遍对比检查,确认无误后,就快速准确的动手实验。
1)酶和dNTP最好分装.
dNTP的质量与浓度: dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1MNaOH或1MTris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0~7.5,小量分装,-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中,dNTP应为50~200umol/L,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。
2)PCR前,将枪等物品放在超净台中,用紫外照射半小时,可以破坏DNA,防止气溶胶污染等。但是,PCR不一定非要在超净台进行,如做质粒PCR就不那么严格.
3)PCR时,试剂化冻后,都稍稍振荡(手弹或者颠倒混匀),离心后再取(通常几秒钟,当转速到2000转左右关离心机)。(1)较均匀;(2)盖上沾的试剂被离下,不浪费试剂和减少污染。质粒DNA在取用之前,混匀的时间要稍长些。
4)PCR反应体系需要在冰上进行配制,以免酶失活或者核酸降解,反应用的器皿和微量离心管都需要进行严格的灭菌。
5),两个引物可以加在一起分装或单独分装都可以.
4、预热PCR仪
上样前,预热PCR仪,对于PFU酶比较关键,先设置好PCR的程序然后再去配体系,别配好体系才想起PCR仪还没开。

5、加样:
1》、加样顺序
1)按照buffer-dNTP-引物-模板-Taq酶-水这个顺序加,不易起泡.
2)或加样顺序倒没有特别要求,只是Taq酶要注意最后加,加完就放到冰箱里或通常在冰箱里面加酶。然后按体积从大到小地一一加入.
3)或珍贵的、易引起污染的物质先加。
比如1、如果样品DNA很稀少,很宝贵,避免DNA间的污染就要首先考虑:第一步先加水,第二步就紧接着加DNA,这样加相同DNA就可以不换TIPS,又不会在DNA中污染引物等其他东西。
比如2、如果用随机引物,缓冲体系和酶就要重点保护???,先加它们再加引物和模板。
比如3、如果用的酶有外切活性,如PyroBest,pfu,就必需把酶放到最后加,否则他们有可能把引物都折磨得面目全非。
2》、混合加样
若做多管的PCR,可先加一起,再用枪分取
比如要做n管,就把除模板之外的其他部分按照n+1份配好,然后再分装,如:
10xbuffer5ul
dNTP4ul
引物11ul
引物21ul
taq酶1ul
ddw34ul
模板2ul
共有9个模板,就把除模板外的其他成分乘10,即buffer50ul,dNTP40ul,引物110ul,引物210ul,taq酶10ul,ddw340ul,加到一个离心管中,加盖,用力振荡使混匀(这步是必要的,否则分到各管中的体系不均匀),稍稍离心一下,然后分装至9个PCR管中,每管48ul,再依次加入模板2ul,混匀,稍稍离心,上机
3》、保证把微量的反应物加进去
1)枪头的下端紧贴液面(不要伸进去太多),若看见有一个小水滴掉进去,证明已经加进去。不过我不赞成紧贴液面加,可能加进空气。所有的试剂都加完后,要用枪混匀,然后用手动离心机离一下,使之没有气泡,不要用手剧烈震荡tube
2)枪头不能挨到液面(加在管壁上瞬时离心),否则使某些物质的量减少,所以我们加样的时候都采取螺旋式加样的方法,也就是加样时沿着管壁螺旋式上升,等全部加完后离心混匀,如果有气泡,用手指轻轻弹几下,气泡就没了(有时ep管内有气泡,反正p时要加温,发现最后结果相差不大),而且确保液体都在管底。
3)在用单个0.2mlPCR薄壁管做反应时,加在管壁,而不是管底,在管壁形成一个小液滴,每个小液滴都孤立存在,用手弹管壁最后离心。在加大量的药品时,如果1ml枪头一下吸满了液体,在枪头提出容器时,枪头尖端可能会存留一滴液体,很容易造成污染和浪费.我的技巧是在枪头提出容器时,将枪头放平,这样枪头尖端会有一个气泡,从而阻止了液体滴的形成!
4》、避免漏加或重复加
1)事先列出清单,准备两个冰盒.将所有的试剂放在一个冰盒上。加完的转移到另一个冰盒,加样以固定的顺序加,这样不容易弄错。
2)少量加样时,可以把试剂分别先加到EP管壁,这样不仅可以确定是否加上了试剂,还可以通过目测比较各种试剂加样是否准确;
3)加样时,将所有的试剂放在冰盒上。没加的在一侧,加完的转移到另一侧。
4)将PCR试剂放在最右边的竖排,再将EP管从左边开始横排放,在每加一种试剂后一定要将EP管挪动一排,这样就可以清楚的区分哪些管加了
5)还有如没有太大影响的话,将加完的合上盖子,没加的盖子打开。
6)泡沫(软的那种)制作了个板子,把ep管放上去,在加样时用枪尖压下
5》、准确浓度:
1)试剂完全化后再加样,浓度准确。像镁离子,融化后最后用枪头再吹打完全混匀。
2)各种酶,用之前瞬时离心一下,如果买的大包装的,最好分装一下,以避免反复冻融。
3)试剂用之前瞬时离心一下.
6》、注意枪头和枪是否结合紧密,否则误差将会很大;
7》、枪头:枪头要买好的,不然你有好枪也没用。
有很多方面你需要考虑,最重要的根据基因多态性频率为指标估算需要总样本量,如果其发生数服从Poisson分布,就采用Poisson分布的公式;其次根据基因多态性对你研究的疾病结局的相对危险度为指标估算需要病例数,具体的计算采用W. James Gauderma。
ctdna是什么123
2017-10-03
它是最新发现的一种具备广泛应用前景、高敏感性、高特异性的肿瘤标志物,且适用于多种肿瘤。
在定量PCR时,我们常常纠结一个问题,究竟是相对定量还是绝对定量呢?如今,你无需纠结了,因为数字PCR(digital PCR)来了。尽管这两种技术有些类似,都是估计起始样品中的核酸量,但它们有一个重要的区别。定量PCR是依靠标准曲线或参照基因来测定核酸量,而数字PCR则让你能够直接数出DNA分子的个数,是对起始样品的绝对定量。因此特别适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域:拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究(如等位基因不平衡表达)、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。
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