
Overview:
Vimentin is a member of intermediate filament family of proteins and is an important structural feature of eukaryotic cells (1). Along with microtubules and actin microfilaments, Vimentin make up the cytoskeleton component of cells. Studies have shown that Vimentin is attached to the nucleus, endoplasmic reticulum and mitochondria, either laterally or terminally. Vimentin plays a significant role in supporting and anchoring the position of the organelles in the cytosol (2). Thus, Vimentin plays a key role in maintaining cell shape, integrity of the cytoplasm, and stabilizing cytoskeletal interactions
Gene Aliases:
VIM, FLJ36605
Genbank Number:
NM_003380
References:
1. Fuchs, E., et al: Intermediate filaments: structure, dynamics, function, and disease". Annu Rev Biochem,1994; 63: pp. 345-82. 2. Katsumoto, T. et al: The role of the vimentin intermediate filaments in rat 3Y1 cells elucidated by immunoelectron microscopy and computer-graphic reconstruction. Biol Cell,1990; 68 (2): pp. 139-46.
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各种tRNA的一级结构互不相同,但它们的二级结构都呈三叶草形。这种三叶草形结构的主要特征是,含有四个螺旋区、三个环和一个附加叉。四个螺旋区构成四个臂,其中含有3′末端的螺旋区称为氨基酸臂,因为此臂的3′-末端都是C-C-A-OH序列,可与氨基酸连接。三个环分别用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示。环Ⅰ含有5,6二氢尿嘧啶,称为二氢尿嘧啶环(DHU环)。环Ⅱ顶端含有由三个碱基组成的反密码子,称为反密码环;反密码子可识别mRNA分子上的密码子,在蛋白质生物合成中起重要的翻译作用。环Ⅲ含有胸苷(T)、假尿苷(ψ)、胞苷(C),称为TψC环;此环可能与结合核糖体有关。tRNA在二级结构的基础上进一步折叠成为倒“L”字母形的三级结构(图3-2-6)。
tRNA分子中稀有碱基的数量是所有核酸分子中比例最高的,这些稀有碱基的来源是转录之后经过加工修饰形成的。
tRNA共有61种,对应61种氨基酸的密码子(64种密码子中,2个是起始密码子,且对应一定氨基酸;3个是终止密码子,不对应氨基酸)
RNA制备过程中究竟有哪些问题需要注意,又有哪些工具可以助我们一臂之力呢,且听下文分解。
RNA制备的四大祸害碱性条件、金属离子和高温都会促使RNA分子水解。因此,RNA操作一般在0°C-4°C的中性或微酸性缓冲液中进行,人们也常常在其中添加螯合剂,比如0.1mMEDTA。有些应用不允许EDTA的存在,这时可以通过离子交换树脂来去除阳离子。
在制备RNA时,RNase一直是个令人头疼的大问题,因为这种酶基本上无处不在。生物样品本来就含有RNase,它们存在于细胞的小隔间里,当细胞被裂解时这些RNase就释放出来。另外,实验室操作也很容易引入RNase。“这种酶到处都是,我们皮肤细胞上就有。如果你戴着手套接触了脸或者手臂,也会沾到一些RNase,”Promega公司的产品经理EricVincent提醒道。
在收获组织或细胞时,“提取RNA要越快越好,或者就想办法令RNase失活,”NEB公司的RNA研究带头人BretRobb指出。
如果不能立刻提取RNA,就应当通过速冻来稳定样本,或者将样本储存在特殊的RNA保存液中,比如AllProtectTissueReagent、RNAlater。此外,PreAnalytiX公司的PAXgeneBloodRNATube也很适合保存这样的样本,“不仅能确保RNA的安全,而且让细胞不会因为温度或缓冲液条件的改变表达任何转录本,”Qiagen公司的MartinSchlumpberger介绍道。PreAnalytiX是BD和QIAGEN的一个合资公司。
绝大多数RNA分离试剂盒中的裂解缓冲液(例如Qiagen公司的RNAEasy),“可以失活任何样本所带的RNAse,”Schlumpberger解释道。“这些产品对于RNA来说是相当安全的。”如果你更喜欢自己DIY,那么异硫氰酸胍、酚/氯仿和SDS都能帮你保护样本中的RNA。
据介绍,RNA纯化之后对环境中的RNAse最为敏感,这个时候需要特别注意预防RNAse的污染。
可不可以做到万无一失如何才能保证RNA实验的成功,这已经是一个老生常谈的问题了。RNA操作时应该戴上一次性手套,并且在专门的空间里进行,尤其要与质粒制备和细菌操作分开。操作者尽量不要接触洁净度不能令人百分百放心的物品。
我们来看看NEB公司是如何做到万无一失的。NEB公司的RNA实验室统一使用RNA专用的一次性耗材。他们认为高压灭菌会使溶液中的微生物释放出RNase,而这些RNase会在灭菌之后复性。因此NEB公司只信任经过认证的无RNAse器皿,抛弃了高压灭菌过程。Robb介绍道,目前市面上有许多经过认证的RNA专用产品(试剂盒、试剂和耗材),进行RNA实验已经比十几年前容易得多了。
“过去人们在配制溶液的时候总是胆战心惊,恨不得屏住呼吸进行称量和搅拌,以免把RNase带到样本中去,”他解释道。而现在,你可以很方面的买到各种无RNAse的试剂,从水、1MTris到5MNaCl。“使用这些试剂可以为RNA实验提供额外的保障。”
许多无核酶的塑料产品都经过了第三方的检测和认证,MoBioLaboratories就提供这样的服务。“我们可以帮助制造商建立始终如一的无污染生产线,”培训操作者如何识别和消除污染源,MoBio公司的CarlTsang介绍道。
我国大多数实验室还是使用玻璃器皿,这些器皿至少需要在180°C的条件下烘烤几个小时,才能确保将RNAse永久性地摧毁。之后,研究者们可以通过商业化的试剂盒进行RNAse检测,比如NEB公司的RNAse污染分析试剂盒。
添加剂的使用DEPC(Diethylpyrocarbonate)一直被用于处理水和溶液,失活其中的RNAse。“多余的DEPC可以在高压锅中去除,因为DEPC在高温下很不稳定,会释放出CO2然后消失,”Schlumpberger说。不过许多人并不爱和这种可能致癌的化合物打交道,Schlumpberger强调,如果没有正确处理,残余的DEPC也会使RNA失活。
对于那些不能高压灭菌的器物,我们可以用RNaseAway试剂处理,然而将其浸泡在无RNAse的水里。
Vincent指出,RNAse抑制剂的使用应当成为常规。以Promega公司的RNAsin为例,RNAse抑制剂能够特异性结合并抑制实验室中常见的RNAse,包括RNAseA、B、C和人胎盘RNAse。“等你发现引入了RNAse时往往已经太迟了,多加一层保险是很有必要的,”他说。
只要我们了解威胁RNA的主要因素(高pH、高温、金属离子和内切酶),就能够想办法一一化解。这时你会发现,RNA制备其实并没有那么难。
http://seq.cn/article-10584-1.html

