动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系,具有不同基因的B淋巴细胞合成不同的抗体.当机体受抗原刺激时,抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞.被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞,大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中.如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养,就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群,即单克隆.单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体,称为单克隆抗体. 简介 1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在自然杂交技术的基础上,创建立杂交瘤技术,他们把可在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠脾细胞融合,成为杂交细胞系,既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性,又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点.将这种杂交瘤作单个细胞培养,可形成单细胞系,即单克隆.利用培养或小鼠腹腔接种的方法,便能得到大量的、高浓度的、非常均一的抗体,其结构、氨基酸顺序、特异性等都是一致的,而且在培养过程中,只要没有变异,不同时间所分泌的抗体都能保持同样的结构与机能.这种单克隆抗体是用其他方法所不能得到的. 这项新技术从根本上解决了在抗体制备中长期存在的特异性和可重复性问题,可用于探讨①蛋白质的精细结构；②淋巴细胞亚群的表面新抗原；③组织相容性抗原；④激素和药物的放射免疫（或酶免疫）分析；⑤肿瘤的定位和分类；⑥纯化微生物和寄生虫抗原；⑦免疫治疗和与药物结合的免疫-化学疗法 (“导弹”疗法,利用单克隆抗体与靶细胞特异性结合,将药物带至病灶部位.因此,单克隆抗体可直接用于人类疾病的诊断、预防、治疗以及免疫机制的研究,为人类恶性肿瘤的免疫诊断与免疫治疗开辟了广阔前景. 2制备过程 1、免疫动物 免疫动物是用目的抗原免疫小鼠,使小鼠产生致敏B淋巴细胞的 过程. 一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠,按照预先制定的免疫方案进行免疫注射. 抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官,刺激相应B淋巴细胞克隆,使其活化、增殖,并分化成为致敏B淋巴细胞. 2、细胞融合 采用眼球摘除放血法处死小鼠,无菌操作取出脾脏,在平皿内挤压研磨,制备脾细胞悬液. 将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合,并加入促融合剂聚乙二醇.在聚乙二醇作用下,各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合,形成杂交瘤细胞. 3、选择性培养 选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞,一般采用HAT选择性培养基.在HAT培养基中,未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶,不能利用补救途径合成DNA而死亡. 未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶,但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡. 只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶,并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性,因此能在HAT培养基中存活和增殖. 4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化 在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞,只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞,因此,必须进行筛选和克隆化.通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养.采用灵敏、快速、特异的免疫学方法,筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞,并进行克隆扩增.经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后,及时进行冻存. 5、单克隆抗体的大量制备 单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养法. (1)体内诱生法 取Balb/c小鼠,首先腹腔注射0.5ml液体石蜡或降植烷进行预处理.1-2周后,腹腔内接种杂交瘤细胞.杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖,并产生和分泌单克隆抗体.约1-2周,可见小鼠腹部膨大.用注射器抽取腹水,即可获得大量单克隆抗体. (2)体外培养法 将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养.在培养过程中,杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体,收集培养上清液,离心去除细胞及其碎片,即可获得所需要的单克隆抗体.但这种方法产生的抗体量有限.各种新型培养技术和装置不断出现,大大提高了抗体的生产量.
一.血清ǐ-球蛋白的初步提取
1. 血细胞与血清分离：
取人血液 1000ml,放置10min, 1000rpm离心20min .弃沉淀,留上清备用(沉淀为血细胞,上部为血清).
2. 乳糜粒分离：4000rpm 10°C离心10分钟,采用密度梯度离心
梯度液配置：离心管下部3/4容积加血浆,上部1/4容积加0.5MnaCl+0.3MEDTA,PH7.4 乳糜粒上浮,将乳糜粒吸出,留其余液体备用.
3. 血清蛋白分离：除去球蛋白,白蛋白及其它蛋白质.
5000rpm 10°C离心1h,密度梯度离心
梯度.液配置：管容量1/3为血清,2/3为1.31g/ml,NaCl+NaBr,搅拌后终密度为1.21g/ml .管上部1/6容积为血清脂蛋白,下部5/6为其它蛋白.
4.取2ml下部5/6血清于小试管中,加0.9％氯化钠溶液2.0ml,边搅拌混匀边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液乙4.0ml,加入PBS洗脱液2ml,混匀后于室温中放置10min,此步骤可重复1～2次
3000rpm 离心5min.沉淀物即是ǐ-球蛋白.
二.凝胶层析提纯血清ǐ-球蛋白(1)装柱：海绵垫装入玻璃柱底端,作为柱底支持物,装入定量的蒸馏水(约为柱体积的1/5),以避免胶粒直接冲击柱底支持物;用玻璃棒小心排除柱底支持物.将密实洗净的层析柱保持垂直位置,关闭出口,柱内留下约2.0ml洗脱液.边搅拌凝胶,边向柱内缓慢,连续,均匀地加入凝胶,(打开柱底端的螺旋夹)不要中断,使胶粒均匀沉降,以免胶面一次性将疑胶从塑料接口加入层析柱内,打开柱底部出口,调节流速0.3ml/min.凝腔随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降到层析柱底部倾斜和发生断层;检查装好的凝胶柱用眼观察有无凝胶分层.沟流和气泡现象.最后使凝胶床达20厘米高,床面上保持有洗脱液,操作过程中注意不能让凝胶床表面露出液面并防止层析床内出现“纹路”.用缓冲液平衡凝胶柱,流速控制在3-5s/滴.(2)上样与洗脱：小心控制凝胶柱下端活塞,使柱上的缓冲液面刚好下降至凝胶床表面,关紧下端出口,用长滴管吸取盐析法制备的球蛋白混合样品,将装有上样液的滴管头插入床面以上1-2cm处,小心缓慢地贴壁加到凝胶床表面.柱上样量控制在柱体积的2%-5%.打开下端出口,将流速控制在0.25ml/min使样品进入凝胶床内.关闭出口,小心加入少量0.0175mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)洗柱内壁.打开下端出口,待缓冲液进入凝胶床后再加少量缓冲液.如此重复三次,以洗净内壁上的样品溶液.然后可加入适量缓冲液开始洗脱.加样开始应立即收集洗脱液.洗脱时接通蠕动泵,流速为0.5ml/min,用部分收集器收集,每管1ml.(3)洗脱液中NH4+与蛋白质的检查：取比色板两个(其中一个为黑色背底),按洗脱液的顺序每管取一滴,分别滴入比色板中,前者加双缩脲2滴,出现蓝色混浊即示有蛋白质析出,由此可估计蛋白质在洗脱各管中的分布及浓度；于另一比色板中,加人奈氏试剂l滴,以观察NH4+出现的情况. 合并球蛋白含量高的各管,混匀.除留少量作电泳鉴定外,其余用DEAE纤维素阴离子交换柱进一步纯化.三．纯化――DEAE纤维素阴离子交换层析用DEAE纤维素装柱约8-10cm高度,并用0.0175mol／L磷酸盐缓冲液(pH6.3)平衡,然后将脱盐后的球蛋白溶液缓慢加于DEAE纤维素阴离子交换柱上,用同一缓冲液洗脱、分管收集.用20％磺基水杨酸溶液检查蛋白质分布情况.(装柱、上样、洗脱,收集及蛋白质检查等操作步骤同凝胶层析).四．浓缩经DEAE纤维素阴离于交换柱纯化的γ－球蛋白液往往浓度较低.为便于鉴定,常需浓缩.收集较浓的纯化的γ－球蛋白溶液2m1,按每ml加0.2～ 0.25gSephadex G一25干胶,摇动2～3min, 3000r／min 离心5min.上清液即为浓缩的γ-球蛋白溶液.五. 乙酸纤维素薄膜电泳鉴定ǐ-球蛋白(一)仪器与薄膜的准备1.醋酸纤维素薄膜的润洗与选择用竹夹子取一片薄膜,小心地平放在盛有缓冲液的平皿中,若漂浮于液面的薄膜在15—30s内迅速润湿,整条薄膜色泽深浅一致,则此膜均匀可用于电泳；若薄膜润湿缓慢,色泽深浅不一或有条纹及斑点等,则表示薄膜厚薄不均匀应弃去,以免影响电泳结果.将选好的薄膜用竹子轻压,使其完全浸泡于缓冲液中约30min后,方可用于电泳.
2.电泳槽的准备根据电泳槽膜支架的宽度,剪裁尺寸合适的滤纸条.在两个电极槽中,各倒入等体积的电极缓冲液,在电泳槽的两个膜支架上,各放两层滤纸条,使滤纸一端的长边与支架前沿对齐,另一端浸入电极缓冲液内.当滤纸条全部润湿后,用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡,使滤纸的一端能紧贴在膜支架上.滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁,因而称为滤纸桥.
3.电极槽的平衡用平衡装置(或自制平衡管)连接两个电泳槽,使两个电极槽内的缓冲液彼此处于同一水平状态,一般需平衡15——20min.注意,取出平衡装置时应将活塞关紧.
(二)点样
1.制备点样模板取一张干净滤纸(10×10cm),在距纸边1.5cm处用铅笔划一平行线,此线为点样标志区.
2.点样用竹夹子取出浸透的薄膜,夹在两层滤纸间以吸去多余的缓冲液.无光泽面向上平放在点样模板上,使其底边与模板底边对齐.点样区距阴极端1.5cm处.点样时,先用玻璃棒或血色素吸管取2—3��L血清,均匀涂在加样器上,再将点样器轻轻印在点样区内,使血清完全渗透至薄膜内,形成一定宽度、粗细均匀的直线.此步是实验的关键,点样前应在滤纸上反复练习,掌握点样技术后再正式点样.
(三).电泳用竹夹子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上(点样面朝下),另一端平贴在阳极端支架上,要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直,中间不能下垂.如一电泳槽中同时安放几张薄膜,则薄膜之间应相隔几毫米.盖上电泳槽盖,使薄膜平衡10min.用导线将电泳槽的正、负极与电泳仪的正、负极分别连接,注意不要接错.在室温下电泳,打开电源开关,用电泳仪上细调节旋扭调到每厘米膜宽电流强度为0.3mA(8片薄膜则为4.8mA).通电10—15min后,将电流调节到每厘米膜宽电流强度为0.5mA(8片共8 mA),电泳时间约50—80min.电泳后调节旋扭使电流为零,关闭电泳仪切断电源.
(四).染色与漂洗
1.血清蛋白染色与漂洗脱色用解剖镊子取出电泳后的薄膜,放在含0.5%氨基黑10B染色液的培养皿中,浸染5min,取出后再用漂洗液浸洗脱色,每隔10min 换漂洗液一次,连续数次,直至背景蓝色脱尽.取出薄膜放在滤纸上,用吹风机的冷风将薄膜吹干.
(五)透明将脱色吹干后的薄膜浸入透明甲液中2min,立即放入透明乙液中浸泡1min,取出后立即紧贴于干净玻璃板上,两者间不能有气泡,约2—3min薄膜完全透明.若透明太慢可用滴管取透明乙液少许在薄膜表面淋洗一次,垂直放置待其自然干燥,或用吹风机冷风吹干且无酸味.再将玻璃板放在流动的自来水下冲洗,当薄膜完全润湿后用单面刀片撬开薄膜的一角,用手轻轻将透明的薄膜取下,用滤纸吸干所有的水分,最后将薄膜置液体石蜡中浸泡3min,再用滤纸吸干液体石蜡,压平.此薄膜透明,区带着色清晰,可用于光吸收计扫描.长期保存不褪色.
(六)结果判断与定量血清蛋白电泳经蛋白染色后,可显示出区带,未经透明处理的电泳图谱可直接用于定量测定.可采用洗脱法或光吸收扫描法,测定各蛋白组分相对百分含
