Storage and Rehydration: Store freeze-dried solid at 2-8°C. Rehydrate with the indicated volume of dH2O (see product specification sheet) and centrifuge if not clear. Prepare working dilution on day of use. Product is stable for about 6 weeks at 2-8°C as an undiluted liquid.Extended Storage after Rehydration: Aliquot and freeze at -70°C or below. Avoid repeated freezing and thawing. Alternatively, add an equal volume of glycerol (ACS grade or better) for a final concentration of 50%, and store at -20°C as a liquid. Expiration date: one year from date of rehydration. The expiration date may be extended if test results are acceptable for the intended use.
Purity:Based on immunoelectrophoresis at an antigen concentration of 20 mg/ml, the pattern of precipitation against goat anti-rat whole serum is the same as that against goat anti-rattransferrin.No precipitin line was detected against goat anti-rat IgG (H+L). Transferrin is manufactured as the iron bound form, commonly referred to as Holo-Transferrin. Buffer: 0.01M Sodium Phosphate, 0.25M NaCl, pH 7.6 Stabilizer:15 mg/ml Bovine Serum Albumin (IgG-Free, Protease-Free) Preservative:0.05% Sodium Azide ConjugateCyanine Cy™3
Amax: 550Emax: 570nmCy3 is brighter, more photostable, and gives less background than other orange-red fluorescing dye conjugates. Cy3 conjugates can be excited maximally at 550 nm, with peak emission at 570 nm. For fluorescence microscopy, Cy3 can be visualized with traditional tetramethyl rhodamine (TRITC) filter sets, since the excitation and emission spectra are nearly identical to those of TRITC. We recommend Cy3 as a brighter alternative to TRITC. Cy3 can be excited to about 50% of maximum with an argon laser (514 nm or 528 nm lines), or to about 75% of maximum with a helium/neon laser (543 nm line) or mercury lamp (546 nm line). Cy3 has been used with fluorescein for double labeling; however, the use of a narrow band-pass emission filter for fluorescein is recommended to minimize Cy3 fluorescence in the FITC filter set. Cy3 can also be paired with Alexa Fluor® 647 for multiple labeling when using a confocal microscope. However, a better choice for multiple labeling is Rhodamine Red-X because its fluorescence is midway between a green fluorescing dye (like Alexa Fluor® 488) and a far-red-fluorescing dye like Alexa Fluor® 647.
Images & ReferencesThis product is for in vitro research use only. It is not a medical device and it is not intended for diagnostic or therapeutic purposes.
Cy is a trademark of GE Healthcare Bio-Sciences Ltd. Jackson ImmunoResearch is licensed by GE Healthcare Bio-Sciences Ltd. to manufacture and sell conjugates of Cy2, Cy3, and Cy5 reactive dyes under US Patent Number 5,268,486, and other patents pending.
Jackson总部位于美国宾夕法尼的兰卡斯特，距离费城大概有40英里。Jackson在1982年由科学家展开了包括在细胞生物学，蛋白质化学，微生物学，免疫学及产品开发实验研究。我们的目标是为世界各地的研究者能最大选择的提供最高质量的科学试剂以及最棒的技术支持和售后服务。蚂蚁淘向您提醒的是，Jackson产品仅用于研究，不用于诊断或治疗用途。作为美国著名的各种二抗生产公司之一，Jackson在全世界各国设有几十家代理。由于其产品效价高、种类全、价格低廉，因而成为全球各大药厂、试剂盒生产厂、大型实验室采购此类试剂的首选。其产品主要包括：各种纯化的二抗、标记的二抗（AMCA、Cy2、FITC、Cy3、TRITC、RRX、TR、Cy5、长臂生物素、辣根酶和碱磷酶标记）、金标试剂等。
Jackson二抗产品选购简介
为便于客户选购Jackson公司的各种二抗，特将选购时的注意事项摘译如下：
JacksonImmunoResearch的抗体产品线完全，有全球最大的二抗产品库，能提供多种应用类型和需要的二抗产品，其二抗产品本身也具有极高的产品质量和稳定性。以上述产品为例，其HRP酶标山羊抗小鼠二抗，WB实验的应用稀释比率为1:10000-1:200000，也就是说，购买的2ml二抗，实际应用时相当于20L-400L的最终使用液。另外，一次购买大包装，避免了不同批次之前的差异，降低了实验条件本身的误差。作为多家著名品牌的代理商，蚂蚁淘根据国内科研的现实需求，为客户选择最具性价比的二抗及血清产品免疫学解决方案。如果您对Jackson的产品感兴趣，请致电027-84454412到蚂蚁淘科技有限公司问询您所感兴趣的产品类型。
JacksonImmunoResearchLaboratories,INC.专业致力于亲和纯化的二抗和免疫球蛋白的生产及偶联。产品主要销往世界各地的大学和科研院所。该公司位于宾夕法尼亚州费城以西约40英里，始建于1982年，经过40年左右的发展，Jackson的二抗以种类丰富（物种齐全，标记多样，应用广泛）、性价比高、供货迅捷而受到更多科研学者和工业客户的青睐。
Jackson的产品主要有酶标二抗、荧光标记二抗、生物素标记二抗、胶体金标记二抗、封闭血清等等，其中JacksonHRP标记羊抗兔/羊抗鼠二抗，更是很多生产厂家的重要物料之一。苏州蚂蚁淘生物科技有限公司作为Jackson在中国的代理商，备有大量二抗现货，并能提供专业的售前咨询和完善的售后服务。
JacksonImmunoResearchLaboratories,INC.专业致力于亲和纯化的二抗和免疫球蛋白的生产及偶联。产品主要销往世界各地的大学和科研院所。该公司位于宾夕法尼亚州费城以西约40英里，始建于1982年，经过40年左右的发展，Jackson二抗以种类丰富（物种齐全，标记多样，应用广泛）、性价比高、供货迅捷而受到更多科研学者和工业客户的青睐。
Jackson的所有产品均具有极高的纯度和高超的品质，大部分二抗产品以冻干粉形式存在，易于保存和运输；作为二抗的实际生产商（非OEM商），产品的性价比也是非常高的，很多大厂家诸如T.F等也会从JacksonOEM产品。另外厂家完善的库存和供应体系以及高效稳定的纯化技术，保证了大部分二抗产品均能现货形式供应，不同批次的产品质量的稳定性也非常高。
Jackson的产品主要有酶标二抗、荧光标记二抗、生物素标记二抗、胶体金标记二抗、封闭血清等等，其中JacksonHRP标记羊抗兔/羊抗鼠二抗，更是很多生产厂家的重要物料之一。苏州蚂蚁淘生物科技有限公司作为Jackson在中国代理商，备有大量二抗现货，并能提供专业的售前咨询和完善的售后服务。
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【教学内容一】分段盐析法，凝胶过滤法(盐析法概念及原理，分段盐析概念，分子筛效应，柱层析基本技术)
【实验原理】1.盐析法是一种利用蛋白质在高盐溶液中溶解度不同而分离的方法。通过将硫酸铵加入蛋白质溶液中，使蛋白质表面电荷被中和，水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀。2.通过分段改变盐类浓度达到分离目的的方法叫分段盐析法。3.凝胶过滤又称分子筛层析。混合物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时，分子量大的物质因不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间的空隙先被洗脱(阻力小,流程短,流速大),分子量小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞,流速缓慢,流程长而后被洗脱,由于流速不同可以把大小不同的分子分开.
【仪器与试剂】1.离心机2.真空泵3.饱和硫酸铵溶液：称取767g固体硫酸铵，加入1000ml水中，加热使之溶解，室温冷却后4℃静置过夜，然后用氨水将pH调至中性。4.固体(NH4)2SO45.SephadexG—256.奈氏试剂7.双缩脲试剂8.pH7.4,0.05MPBS
【步骤】
一分段盐析
1.观看人血清抗胰蛋白酶(α1-AT)的分离及鉴定教学录像2.每组量取20ml血清，倒入一干净烧杯中，缓慢加入饱和硫酸铵20ml，边加边搅拌,放入4℃冰箱30分钟3.从冰箱中取出烧杯，将血清倒入离心管，3000rpm，离心20分钟4.将上清倒入一干净量筒中，记录体积后，倒入干净烧杯中，按17.6g/100ml量取固体硫酸铵，缓慢加入上清中，边加边搅拌。4℃冰箱放置30分钟5.将烧杯中液体倒入抽滤器中，负压抽滤6.刮下滤纸上的粗提蛋白，用4ml缓冲液溶解，准备加样
二凝胶过滤层析
1.凝胶柱准备：(1)连接层析柱(2)夹住出口，加入1/3体积的0.05MpH6.4PBS，灌胶，待凝胶自然沉降约1cm时，打开出口，控制流速，60滴/分(3)层析柱填装完成后，连接下口瓶，调节流速，使入口和出口流速相同。平衡至入口pH值与出口pH值相同(即pH试纸呈色相同)，关闭出口，等待加样2.加样：用吸管吸去胶面以上的缓冲液，立即加入蛋白粗提液(沿管壁缓慢加入)3.打开出口，调流速15滴/分，待蛋白粗提液完全进入胶面，用少量缓冲液清洗管壁。连接下口瓶4.检测：用双缩脲试剂检测洗脱液。待试剂变红，开始收集，直到试剂不变色停止收集。测量并记录收集液的体积，留取1ml样品(标记为G—25样品)，放入一冷冻管中冰箱冻存;剩余的液体收集入一大试管中，作好标记，下次实验用5.洗去铵盐：全速洗脱，用奈氏试剂检测洗脱液，直到橙色消失为止，回收凝胶
【注意事项】1.盐析所用器皿一定要干燥2.盐析时，应将饱和硫酸铵或固体硫酸铵加入到血清中，且边加边搅拌3.层析柱上方要留有少量液体，避免使凝胶暴露于空气中4.凝胶过滤上样时，使样品沿管壁缓缓流下，勿冲破胶面
（信息提供：探生网生物医药）
1.以沉淀形式保存在高浓度的硫酸铵中。
2.添加50%甘油冷冻，尤其适用于酶类。
3.如果样品要用于生物学检测，避免使用防腐剂。在体内实验中不能添加防腐剂，而应当将样品分装成小份冷冻。
4.可使用无菌滤器以延长保存时间。
5.添加稳定剂，如甘油（5-20%）、血清白蛋白（10mg/ml）、配基（浓度取决于活性蛋白的浓度）以帮助维持生物活性。
6.避免反复冻融或冻干重溶解过程，这样很可能会降低生物活性。
7.一些冷沉淀蛋白会在4度沉淀出来，包括一些小鼠IgG3亚族的抗体，不能保存在4度冰箱中，可添加防腐剂保存在室温中。
固定金属离子亲和柱主要用于金属螯化离子。位于许多蛋白中的组氨酸残基将会和许多金属离子，例如锌。铜，镍，铁等形成复合物。因此，该柱料能选择性螯合一些具有组氨酸残基的蛋白质。但是半胱氨酸和咯氨酸残基也能和固定化金属螯和。但是亲和力比组氨酸要弱。所以，结合的强度是和缓冲液的PH和金属离子决定的。
金属螯和柱料主要是由亚氨基的乙酰乙酸成分耦联琼脂糖柱料，借助醚长生7个原子的空间。
全部容量：24-30um的含有zn的干胶
柱料结构：6%的高铰链的琼脂糖
柱料大小：45-165um
平均微粒：90um
直流速度：25度/0.1MPa/30倍柱床/5厘米高度/每小时可达700厘米
最大压强：0.3MPa
PH变化：长期3-13
短期2-14
化学稳定：通用含水缓冲液
0.01M盐酸，1.0M NAOH,20%乙醇（保存7天）
物理性质：可以忽略在PH或者离子变化下的体积变化
耐热性能：121度下0.1M乙酸钠作用半小时
金属螯和柱料保存于事先填充于20%乙醇。所以要搅拌驱除20%乙醇溶液。换成去离子水。比例是25%去离子水和75%处理胶。
处理金属螯和柱料：
1 平衡所有用到的材料于室温。
2 搅拌金属螯和柱料
3 倒水进柱子，驱除气体。用无离子水液封几厘米。
4 将金属螯和柱料连续倒进柱子，用玻璃棒支撑柱壁防止气泡形成。
5 然后立即用无离子水液封，装上柱盖，连接上泵。
6 打开柱子底部的开关，然后调节泵的流速。通常是不超过0.3MPa的。
7 经过一个稳定的柱床填鸭后，维持填压速度为3个柱床。
使用adaptor
1 经过上溯填鸭后，关闭柱床下面开关，移开上面的薄膜，小心的加上去离子水进行液封。
2 一定角度插入adaptor，确保没有气泡。
3 确保所有的连接都没有问题，柱子/泵/样品接受器
4 倾斜插入活塞确保没有气泡和管道充满液体。利用活泵正反向的流动确保没有气泡。
5 固定adaptor，打开柱子开关，开始缓冲液的流动。先以填鸭的速度直到柱床稳定后。
固定金属离子：
金属螯和柱料通过水来螯和金属的，避免发生沉淀在胶上。
1 确保柱子已经平衡好。如果有必要可以洗2个柱床（去离子水）
2 选择金属离子和0.1-0.3M中弱性酸。例如铁离子PH 3左右就好，避免形成沉淀和共沉。
3 加入一倍柱床的金属离子溶液
45倍柱床的去离子水洗涤
5至少2倍柱床的平衡缓冲液
结合：
发生于PH5.5-8.5之间.最强反映发生于最后
初始缓冲液的选择决定于金属离子和样品的结合性质。乙酸钠或者磷酸钠是比较好的缓冲液中不能使用EDTA或者柠檬酸盐
最通用缓冲液：
0.01-0.2M磷酸钠
0.05M乙酸钠
强烈推荐加入0.15-0.5M NaCl用于防止离子交换。
通常如果不知道一个蛋白的结合能力，最好的就是使用锌离子和中性的磷酸或者乙酸盐，同时含有0.15-0.5M NaCl
去垢剂不会影响蛋白质的结合能力
金属离子的取代意味着蛋白发生了结合。这种现象可以通过颜色来决定
洗脱蛋白：（3种方法）
1 降低PH(一步或者分步)，大部分蛋白溶解于PH4-6最终3-4是可容的。可选择柠檬酸盐，磷酸或者乙酸盐。
2 逐步提高咪唑的浓度（0-0.5M），梯度变化最好是在初始缓冲液的PH范围。
3 加入EDTA或者EGTA可洗脱蛋白质。但是不是通用的。
利用离心或者重力作用纯化组氨酸位点蛋白
通过上镍进行选择性结合含有组氨酸位点蛋白，然后利用含有咪唑的缓冲液洗脱蛋白。
以下的实验是为了最大化将组氨酸位点蛋白结合到金属螯和柱料，然后确保能够洗脱下来。当结合和洗脱的条件尚未明了时，这些方法也是很好用的。
为了获得高纯度的蛋白，必须摸索咪唑的缓冲液在样品上柱和洗脱时的浓度。通常使用10mM-500mM范围的咪唑的缓冲液进行剃度洗脱，然后通过收集和SDS-PAGE 蛋白电泳确定洗脱浓度。
为了纯化不可容的含有his位点的蛋白质，（包含体），可以在变性条件下进行。利用8M尿素或者6M盐酸呱进行溶解蛋白。
样品处理：
样品要经可能溶解，避免出现堵塞现象，所以可以利用0.45uM虑膜过滤杂志
如果样品时溶解于20mM磷酸缓冲液中（含有0.5M Nacl,PH7.4），必须调整PH到7－8。
上柱前准备：
洗柱料：
1 亲柔震动胶瓶充旋胶料
2 利用吸管吸出足量柱料用以纯化目的。每毫升柱料可以吸纳5毫克蛋白
3 500g 离心2－5分钟，沉淀柱料。
4 小心去除上清
5 加入5倍体积去离子水，充分振荡柱料。可以倒置来回5分钟，不要机械搅拌。
6 再次500g 离心2－5分钟，沉淀柱料。
7 再次小心去除上清
挂镍：
1 加入0.5倍柱床体积0.1M硫酸镍，充分振荡柱料。可以倒置来回5分钟，不要机械搅拌。
2500g 离心2－5分钟，沉淀柱料。
3小心去除上清
洗柱：
1加入5倍体积去离子水，充分振荡柱料，来回倒置5分钟
2500g 离心2－5分钟，沉淀柱料。
3小心去除上清
4 再洗两次柱料（一共3×5柱床去离子水）
5 最后用一倍体积起始缓冲液充旋柱料（20mM Na2HPO4 /0.5MnaCl/10mM咪唑/PH7.4）
利用离心来纯化：
上样：
1 在起始缓冲液中加入样品，然后使整体胶浓度达到50％
2 亲柔搅拌，室温离心5－30分钟，结合能力取决于蛋白和样品浓度。
3 500g 离心2－5分钟，沉淀柱料。
4 取出上清。部分用于SDS-PAGE 蛋白电泳
洗胶：
1 加入5倍体积起始缓冲液，搅拌5分钟
2 500g 离心2－5分钟，沉淀柱料。
3取出上清。部分用于SDS-PAGE 蛋白电泳
4再洗两次柱料（一共3×5柱床起始缓冲液）。记得取出上清，部分用于SDS-PAGE 蛋白
电泳
洗柱：
1 加入2倍体积洗脱缓冲液（20mM Na2HPO4 /0.5MnaCl/10mM咪唑/PH7.4）搅拌5分钟
2再次500g 离心2－5分钟，沉淀柱料。
3再洗四次柱料（一共5×2柱床洗脱缓冲液）。记得取出上清，部分用于SDS-PAGE 蛋白电泳，280nM吸光值，ELISA,WESTERN
利用流速和重力纯化：
1 在柱子底部加上滤器
2 加水排气
3 加柱帽，去除残余水。推荐是最多2 Ml柱料就可以了
样品结合：
1 倒胶进入柱子
2 小心上样，用波棒室温搅拌5－30分钟
3 打开柱帽，收集流出峰用于分析
洗胶：
1 加入5倍体积起始缓冲液，收集流出液用于SDS-PAGE 蛋白电泳
2再洗两次柱料（一共3×5柱床起始缓冲液）。记得取出上清，部分用于SDS-PAGE 蛋白
电泳
洗柱：
1 加上柱帽，加入2倍体积洗脱缓冲液（20mM Na2HPO4 /0.5MnaCl/10mM咪唑/PH7.4）搅拌5分钟。打开柱帽，收集流出峰
2再洗四次柱料（一共5×2柱床洗脱缓冲液）。记得取出上清，部分用于SDS-PAGE 蛋白电泳，280nM吸光值，ELISA,WESTERN
注意：0.5M咪唑的280nM吸光值＝0.5
常见问题：
1 样品太粘稠
答：核酸存在影响，可以继续超声，加入RNA酶至10ug/mlDNA酶至5ug/ml。然后冰浴1
0－15分钟。或者也可以用注射器来回充旋。这样可以防止堵塞柱料。
2 平衡时样品洗脱了下来
答: 检查PH和缓冲液成分，如果缓冲液成分不正确，EDTA加入，强还原剂加入，都会导致这个现象出现。
加大胶的量，如果胶料承载能力过头，也绘出出现这现象。
准备新鲜的柱料，如果柱料断裂，也挂不上蛋白。
3 在洗脱液中不含有组氨酸蛋白
答：如果SDS-PAGE 蛋白电泳已经发现蛋白存在于超声液中
超声可能不完全。可以用显微镜观察超声情况。AD260/280比值。（通常是超声前将10mg/ml溶菌酶加入25mM Tris-HCL，PH6-8），避免发泡以降解融合蛋白。
蛋白可能是是包含体，可以使用4－6M盐酸呱或者4－8 M尿素溶解。
尿素溶解的可以进行SDS-PAGE 蛋白电泳，盐酸呱溶解的不可以进行SDS-PAGE 蛋白电泳，必须换缓冲液。
洗脱液浓度太稀，可以加大咪唑浓度或者降低PH 来决定最佳洗脱条件如果在平衡前的洗柱发现了目的蛋白，证明起始缓冲液中的咪唑浓度太高，可适当降低。
4 考马氏亮蓝或者银染发现多条带
答：加入蛋白激酶抑制剂。可能是蛋白降解。用凝血酶切割前必须去除丝氨酸蛋白酶抑制剂采用梯度咪唑来洗脱蛋白。在平衡洗脱液中加入10mM咪唑可以洗脱大量杂质而不会洗脱融合蛋白。低于500mM咪唑可以洗掉绝大部分杂质。
在洗脱步奏往起始缓冲液加入去垢剂（2％TRITON x-100或者2％Tween20）50% 葡萄糖，20mM B-巯基乙醇。记得杂质通常没有特意结合能力，可以改变缓冲液来洗脱。
如果杂志和目的蛋白有相同结合能力，那就不能用于纯化。因此可以使用别的纯化系统，例如含有GST尾巴就用谷胱甘肽琼脂糖4B
柱料再生，清洁和保存
柱料再生：
1 使用0.05M EDTA,0.5M NaCl来洗脱镍离子。然后用3柱床的0.5M NaCl来洗干净EDTA
2如果是铁离子可以用0.05M EDTA泡过夜
3 这一步可以洗脱上面未能洗脱的残余结合蛋白
清洗柱料：
1 0.5倍柱床2M NaCl，反向洗脱10－15分钟
2 1M NaOH洗1小时去除残余蛋白
3 每一步都要用3倍柱床起始缓冲液清洗
4 4倍柱床70%乙醇洗脱强亲水蛋白和脂类蛋白。
也可以使用2倍柱床去垢剂。0.1-0.5%非离子去垢剂溶于0.1M乙酸。浸泡1－2小时。最后用5个柱床的70％乙醇去除去垢剂。
清洁：
1 尽可能去除微生物
2 0.5-1M NaOH反向流动半小时
3 再用3－5倍柱床消毒的起始缓冲液平衡
4 这个清洁步奏不一定能够提高纯化能力
保存：
长期保存于20％乙醇或者0.01M NaOH 于4度
血清为去除纤维蛋白原后的无形成分，颜色微黄，透亮。
血清的基本成分是水，水中溶有蛋白质、脂肪、糖、无机盐、维生素等营养成分，也溶有人体代谢产物。血清中有抗体，这是被称作免疫球蛋白的蛋白质。
1. 血细胞与血清分离：
取人血液 1000ml,放置10min, 1000rpm离心20min .弃沉淀,留上清备用(沉淀为血细胞,上部为血清).
2. 乳糜粒分离：4000rpm 10°C离心10分钟,采用密度梯度离心
梯度液配置：离心管下部3/4容积加血浆,上部1/4容积加0.5MnaCl+0.3MEDTA,PH7.4 乳糜粒上浮,将乳糜粒吸出,留其余液体备用.
3. 血清蛋白分离：除去球蛋白,白蛋白及其它蛋白质.
