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| NeurotensinNTR1 activator |
Sample solution is provided at 25 µL, 10mM.
Nature.2017 Jan 19;541(7637):417-420.
Nature.2018 Nov;563(7731):407-411.Nature.2018 Jun 13.Nature.2018 Jun 27.Nature.2018 Mar 29;555(7698):673-677.Nature.2017 Sep 7;549(7670):96-100.Nature.2016 Apr 21;532(7599):398-401.
Science.2016 Aug 5;353(6299)594-8Nat Nanotechnol.2017 Dec;12(12):1190-1198.Nature Biotechnology.2017 Jun;35(6):569-576Nat Med.2018 Sep 17.Cell.2018 Dec 21. pii: S0092-8674(18)31561-7.Cell.Available online 25 October 2018.Cell.2018 Sep 27. pii: S0092-8674(18)31183-8.Cell.2018 Jun 28;174(1):172-186.e21.Cell.2018 Feb 22;172(5):1007-1021.e17.Cell.2017 Nov 30;171(6):1284-1300.e21.Cell.2017 Aug 17. pii: S0092-8674(17)30869-3.Cell.2017 Jul 13;170(2):312-323Nat Med.2018 Jan 29.Nat Med.2017 Nov;23(11):1342-1351.Cell.2017 Apr 6;169(2):286-300.Cell.2015 Aug 27;162(5):987-1002.Cell.2015 Feb 12;160(4):729-44.Nature Medicine.2017 Apr;23(4):493-500.Cancer Cell.2018 May 14;33(5):905-921.e5.Cancer Cell.2018 Apr 9;33(4):752-769.e8.Cancer Cell.2018 Mar 12;33(3):401-416.e8.Cancer Cell.2017 Aug 14;32(2):253-267.e5.Nat Methods.2018 Jul;15(7):523-526.Cell Stem Cell.2018 May 3;22(5):769-778.e4.Cell Stem Cell.2017 Nov 20. pii: S1934-5909(17)30375-2.Quality Control & MSDS
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Chemical structure
Neurotensin Dilution Calculator
calculate
Neurotensin Molarity Calculator
calculate
| Cas No. | 39379-15-2 | SDF | Download SDF |
| Chemical Name | (Z)-5-(((Z)-1-((6-amino-1-(2-((Z)-(((Z)-1-((1-(2-((Z)-(((Z)-1-(((Z)-1-((1-carboxy-3-methylbutyl)imino)-1-hydroxy-3-methylpentan-2-yl)imino)-1-hydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)propan-2-yl)imino)(hydroxy)methyl)pyrrolidin-1-yl)-5-guanidino-1-oxopentan-2-yl)imino) | ||
| Canonical SMILES | CCC(C(/N=C(O)/C(/N=C(O)/C1CCCN1C(C(/N=C(O)/C(/N=C(O)/C2CCCN2C(C(/N=C(O)/C(/N=C(O)/C(/N=C(O)/C(/N=C(O)/C(/N=C(O)/C3CCC(O)=N3)CC(C)C)CC4=CC=C(O)C=C4)CCC(O)=O)CC(O)=N)CCCCN)=O)CCCNC(N)=N)CCCNC(N)=N)=O)CC5=CC=C(O)C=C5)/C(O)=N/C(C(O)=O)CC(C)C)C | ||
| Formula | C78H121N21O20 | M.Wt | 1672.94 |
| Solubility | Soluble to 0.70 mg/ml in sterile water | Storage | Desiccate at -20°C |
| Physical Appearance | White lyophilised solid | Shipping Condition | Evaluation sample solution : ship with blue ice.All other available size:ship with RT , or blue ice upon request |
| General tips | For obtaining a higher solubility , please warm the tube at 37 ℃ and shake it in the ultrasonic bath for a while.Stock solution can be stored below -20℃ for several months. | ||
IC50: N/A
Neurotensin (NT) can activate the G protein-coupled receptor, the neurotensin receptor 1 (NTR1). NT, a 13-amino acid neuropeptide, expressed in the central nervous system, and the intestine, including ileum3 and colon.
Neurotensin receptor 1 (NTR1) is a G protein-coupled receptor (neurotensin, NT) with high affinity.
In vitro: Due to NT/NTR1 signaling potentiates expression of miR-133α, the mechanism of NT-regulated miR-133α expression and examining the role of miR-133α in intracellular NTR1 trafficking in human NCM460 colonocytes are very important. The negative transcription regulator (zinc finger E-box binding homeobox 1) is involved in NT-induced miR-133α upregulation. A binding target of miR-133α (silencing of miR-133α or overexpression of aftiphilin (AFTPH)) lowered NTR1 trafficking to plasma membrane in human colonocytes without affecting NTR1 internalization. AFTPH to early endosomes and the trans-Golgi network (TGN) were localized in unstimulated human colonic epithelial cells. NTR1 localization was reduced by AFTPH overexpression in early endosomes. At the same time, it also increased expression of proteins related to endosomes and the TGN trafficking pathway. NTR1 expression was increased by AFTPH overexpression and de-acidification of intracellular vesicles. These results suggest a novel mechanism of GPCR trafficking in human colonic epithelial cells accounts for why a microRNA, miR-133α regulates NTR1 trafficking through its downstream target AFTPH.
In vivo: So far, no study in vivo has been conducted.
Clinical trial: So far, no clinical study has been conducted.
Reference:[1]. Law IK, Jensen D, Bunnett NW, Pothoulakis C. Neurotensin-induced miR-133α expression regulates neurotensin receptor 1 recycling through its downstream target aftiphilin. Sci Rep. 2016 Feb 23;6:22195.
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蚂蚁淘（www.ebiomall.cn）是中国大陆目前唯一的生物医疗科研用品B2B跨境交易平台，
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2018-06-09
北京华夏远洋科技有限公司在发布的琥珀酸脱氢酶复合体A亚基(SDHA)检测试剂盒(酶联免疫吸附试验法)供应信息，浏览与琥珀酸脱氢酶复合体A亚基(SDHA)检测试剂盒(酶联免疫吸附试验法)相关的产品或在搜索更多与琥珀酸脱氢酶复合体A亚基(SDHA)检测试剂盒(酶联免疫吸附试验法)相关的内容。 查看更多
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上海朗顿生物科技有限公司在发布的组蛋白，冻干粉供应信息，浏览与组蛋白，冻干粉相关的产品或在搜索更多与组蛋白，冻干粉相关的内容。 查看更多
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2021-09-20
四川生工科技有限公司在发布的人T-框蛋白2(TBX2)酶联免疫吸附测定试剂盒供应信息，浏览与人T-框蛋白2(TBX2)酶联免疫吸附测定试剂盒相关的产品或在搜索更多与人T-框蛋白2(TBX2)酶联免疫吸附测定试剂盒相关的内容。 查看更多
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2021-07-16
北京绿源伯德生物科技有限公司在发布的人白细胞活化黏附因子(ALCAM)酶联免疫吸附测定试剂盒供应信息，浏览与人白细胞活化黏附因子(ALCAM)酶联免疫吸附测定试剂盒相关的产品或在搜索更多与人白细胞活化黏附因子(ALCAM)酶联免疫吸附测定试剂盒相关的内容。 查看更多
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2021-08-09
上海柯雷生物科技有限公司在发布的人促肾上腺皮质激素(ACTH)化学发光免疫分析试剂盒 供应信息，浏览与人促肾上腺皮质激素(ACTH)化学发光免疫分析试剂盒 相关的产品或在搜索更多与人促肾上腺皮质激素(ACTH)化学发光免疫分析试剂盒 相关的内容。 查看更多
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2021-09-08
上海信裕生物科技有限公司在发布的Peroxidase-conjugated Streptavidin辣根过氧化物酶标记链霉亲和素供应信息，浏览与Peroxidase-conjugated Streptavidin辣根过氧化物酶标记链霉亲和素相关的产品或在搜索更多与Peroxidase-conjugated Streptavidin辣根过氧化物酶标记链霉亲和素相关的内容。 查看更多
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2021-08-12
包装材料检测仪器制造商-济南赛成电子科技有限公司最新产品宣传文章《冻干粉针剂包装产品物性检测指标汇总》。中国仪器网，致力打造仪器行业互动门户。 查看更多
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2020-05-10
Streptavidin-FITC,Streptavidin-HRP,Streptavidin-PE,Streptavidin-CY3 我公司提供Lifetechnologies 或者southernbiotech公司 查看更多
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2021-08-11
上海朗顿生物科技有限公司在发布的乙醇脱氢酶，冻干粉供应信息，浏览与乙醇脱氢酶，冻干粉相关的产品或在搜索更多与乙醇脱氢酶，冻干粉相关的内容。 查看更多
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2021-08-11
免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学... 查看更多
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2018-06-25
免疫印迹检测试剂ReagentwasdetectedbyWesternblot441迪申生物技术(上海)有限公司免疫印迹检测试剂 查看更多
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2018-07-13
上海东松医疗科技股份有限公司受招标人委托对下列产品及服务进行国际公开竞争性招标，于2018-07-11在中国国际招标网公告。本次招标采用传统招标方式，现邀请合格投标人参加投标。1、招标条件项目概况:免疫代谢中心-落地式离心机壹套（项目预算：人民币350000元，可以采购进口产品）资金到位或资金来源落实情况:已到位项目已具备招标条件的说明:已具备2、招标内容招标项目编号:0811-184DSITC1141招标项目名称:免疫代谢中心-落地式 查看更多
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一抗孵育时间 搜索123
椃棜L2018-02-10
1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时.
2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟
3.PBS洗净:3min*3
4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS
5.PBS洗净:2*5min
6.羊血清封闭：37度，20分钟
7.一抗，4度过夜，一般要大于18小时或者37度 1-2小时
8.4度 PBS洗净，3min*5次
9.二抗 37度小于一小时
2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟
3.PBS洗净:3min*3
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5.PBS洗净:2*5min
6.羊血清封闭：37度，20分钟
7.一抗，4度过夜，一般要大于18小时或者37度 1-2小时
8.4度 PBS洗净，3min*5次
9.二抗 37度小于一小时
【求助】关于ELISA123
jshrh20052006-02-11
【求助】哪位老兄可讲一下SA-ELISA的原理与方法，谢谢！
生物素亲和素系统要注意什么问题– 960问答123
列漥疛咱竂鶇2018-02-11
灵敏度
生物素容易与蛋白质和核酸类等生物大分子结合，形成的生物素衍生物，不仅保持了大分子物质的原有生物活性，而且比恬度高，具多价性。此外，每个亲和素分子有四个生物素结合部位，可同时以多价形式结合生物素化的大分子衍生物和标记物。因此，BAS具有多级放大作用，使其在应用时可极大地提高检测方法的灵敏度。
特异性
亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度专一性。因此，BAS的多层次放大作用在提高灵敏度的同时，并不增加非特异性干扰。而且，BAS结合特性不会因反应试剂的高度稀释而受影响，使其在实际应用中可最大限度地降低反应试剂的非特异作用。
稳定性
亲和素结合生物素的亲和常数可为抗原-抗体反应的百万倍，二者结合形成复合物的解离常数很小，呈不可逆反应性；而且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶以及有机溶剂均不影响其结合。因此，BAS在实际应用中，产物的稳定性高，从而可降低操作误差，提高测定的精确度。
普适性
生物素-结合素系统的多功能性还能提供一套统一的研究方法。例如对于某待测分子，已经得到了对于该分子的生物素标记抗原，那么配合结合亲和素的胶体金可以在电镜下观测，配合结合荧光标记的亲和素可以使用流式细胞仪筛选，配合连接到酶的亲和素可以进行ELISA等免疫组化实验。
生物素容易与蛋白质和核酸类等生物大分子结合，形成的生物素衍生物，不仅保持了大分子物质的原有生物活性，而且比恬度高，具多价性。此外，每个亲和素分子有四个生物素结合部位，可同时以多价形式结合生物素化的大分子衍生物和标记物。因此，BAS具有多级放大作用，使其在应用时可极大地提高检测方法的灵敏度。
特异性
亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度专一性。因此，BAS的多层次放大作用在提高灵敏度的同时，并不增加非特异性干扰。而且，BAS结合特性不会因反应试剂的高度稀释而受影响，使其在实际应用中可最大限度地降低反应试剂的非特异作用。
稳定性
亲和素结合生物素的亲和常数可为抗原-抗体反应的百万倍，二者结合形成复合物的解离常数很小，呈不可逆反应性；而且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶以及有机溶剂均不影响其结合。因此，BAS在实际应用中，产物的稳定性高，从而可降低操作误差，提高测定的精确度。
普适性
生物素-结合素系统的多功能性还能提供一套统一的研究方法。例如对于某待测分子，已经得到了对于该分子的生物素标记抗原，那么配合结合亲和素的胶体金可以在电镜下观测，配合结合荧光标记的亲和素可以使用流式细胞仪筛选，配合连接到酶的亲和素可以进行ELISA等免疫组化实验。
免疫双标二抗的封闭血清选择和二抗的种属来源选择西域123
小伙q662021-07-20
建议使用二抗来源的血清，这样，如果样品对二抗来源有非特异吸附的话，在这一步就可以排除了，降低背景，提高信噪比，比较有利于显现一些弱的信号。
如果封闭不好，二抗直接与样品结合，荧光背景高，就很难判断结果了。
如果封闭不好，二抗直接与样品结合，荧光背景高，就很难判断结果了。
链霉亲和素 碱性磷酸酶 用什么稀释123
败落0dBt2018-02-05
春天的微风已经吹来，寒冷的冬天已经渐渐离我们远去。冷暖季节的交替总是会给我们的身体健康带来影响。如何才能调整好自己的身体来迎接春天呢？生活家小编特别为您准备了最丰富的保健养生知识，帮您过一个健康快乐的春天。 晨起后，先喝一杯白开...5241
贝克曼A63880 核酸纯化试剂盒上海林钊生物科技有限公司123
2021-07-24
ELISA 底物的选择诺为生物是eBioscience, Miltenyi,STEMCELL, ...123
yyfyjp_05072004-08-29
相关疾病：风湿病先天性卵巢发育不全综合征荧光ELISA两种荧光底物和一种显色底物的比较 前言 EIA，酶免疫测定（EnzymeImmunoassay）或称之为ELISA（酶联免疫吸附分析法，Enzyme-LinkedImmunos......
四种核酸染料在琼脂糖凝胶电泳中染色特性的比较分析可编辑.doc123
Kyoya80OH82021-08-03
BAS-ELISA是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素(B)与亲和素(A)间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合。这样，结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。
BAS用于检测的基本方法可分为三大类。
第一类是标记亲和素连接生物化大分子反应体系，称BA法，或标记亲和素生物素法(LAB)。
第二类以亲和素两端分别连接生物素化大分子反应体系和标记生物素，称为桥联亲和素-生物素法(BRAB)。
第三类是将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，再与生物素化的抗抗体接触时，将抗原-抗体反应体系与ABC标记体系连成一体，称为ABC法。这一方法可以将微量抗原的信号放大成千上万倍，以便于检测。 亲和层析是将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液， 改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来。
生物素-亲和素系统可以与亲和层析的方法结合，大大提高纯化蛋白质的纯度，或者为已知配体寻找受体。步骤是首先将生物素共价结合到配体蛋白上，再将生物素化后的配体蛋白加入含有受体蛋白的混合物，然后将此混合物通过预先固定了亲和素的层析柱，这时配体受体复合物就通过生物素-亲和素系统停留在层析柱上，最后通过选择性洗脱获得此受体配体蛋白复合物或者仅有受体。这一方法被广泛运用于药物研发行业，当人们发现某种药物分子具有疗效但是又不清楚它具体作用于哪种蛋白质时，可以将其生物素化然后把靶蛋白从成千上万种蛋白质中“抓”出来。
生物素-亲和素系统还可以用相似的方法分离DNA.方法是在DNA探针的一端挂上生物素，然后用其获得目的DNA片段，再利用固定化的亲和素回收这些DNA。
传统的基因探针是由带放射性的磷酸碱基合成的，我们可以用被生物素标记的磷酸碱基合成基因探针，避免了实验过程中放射性物质可能造成的伤害。
BAS用于检测的基本方法可分为三大类。
第一类是标记亲和素连接生物化大分子反应体系，称BA法，或标记亲和素生物素法(LAB)。
第二类以亲和素两端分别连接生物素化大分子反应体系和标记生物素，称为桥联亲和素-生物素法(BRAB)。
第三类是将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，再与生物素化的抗抗体接触时，将抗原-抗体反应体系与ABC标记体系连成一体，称为ABC法。这一方法可以将微量抗原的信号放大成千上万倍，以便于检测。 亲和层析是将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液， 改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来。
生物素-亲和素系统可以与亲和层析的方法结合，大大提高纯化蛋白质的纯度，或者为已知配体寻找受体。步骤是首先将生物素共价结合到配体蛋白上，再将生物素化后的配体蛋白加入含有受体蛋白的混合物，然后将此混合物通过预先固定了亲和素的层析柱，这时配体受体复合物就通过生物素-亲和素系统停留在层析柱上，最后通过选择性洗脱获得此受体配体蛋白复合物或者仅有受体。这一方法被广泛运用于药物研发行业，当人们发现某种药物分子具有疗效但是又不清楚它具体作用于哪种蛋白质时，可以将其生物素化然后把靶蛋白从成千上万种蛋白质中“抓”出来。
生物素-亲和素系统还可以用相似的方法分离DNA.方法是在DNA探针的一端挂上生物素，然后用其获得目的DNA片段，再利用固定化的亲和素回收这些DNA。
传统的基因探针是由带放射性的磷酸碱基合成的，我们可以用被生物素标记的磷酸碱基合成基因探针，避免了实验过程中放射性物质可能造成的伤害。
人绒毛膜促性腺激素值是多少可以做b超_孕育常识_亲子宝典库...123
舞动装甲丶eq2018-02-06
链霉亲和素分子由4条相同的肽链组成，其氨基酸组成中，甘氨酸和丙氨酸的含量较大，而且结合生物素的活性基团也是肽链中的色氨酸残基；链霉亲和素是一种稍偏酸性（pH6.0）的蛋白质，并且不带任何糖基。在蛋白水解酶作用下，链霉亲和素可在N端10～12和C端19-21间断裂，形成的核心链霉亲和素仍然保持完整的结合生物素的能力。链霉亲和素的活性单位也是以结合1μg生物素所需的量来表示，1mg链霉亲和素的最高活性可达18U。向左转|向右转
三天两觉吧这是三天两觉吧我们的日常是坑别人,写脑洞,...123
°迷岛xQZ32018-02-02
1、问:用免疫荧光方法做组织切片和培养细胞内的蛋白，两者操作过程有哪些不同?
参考见解:只是固定方法不同。细胞固定用甲醇，切片固定用多聚甲醛，而染色方法是一样的。
2、问:近期要做免疫荧光双标，不知哪位有免疫荧光双标技术的详细步骤及其注意事项?
参考见解:我正在做冰冻组织切片的免疫荧光双染。我的经验是:
(1)选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。
(2)我的做法是两种一抗（CHI抗体）同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。
(3)我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。
(4)封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey血清。
(5)其余步骤同一般免疫荧光单标操作。
3、问:本人拟做Brdu标记神经干细胞免疫荧光，二抗为FITC标记，想请教各位大侠:
(1)抗体分装和荧光显微镜观察时是否一定要在暗室中进行?
(2)封片时是否用甘油缓冲液即可，还是用甘油和0.5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氢盐缓冲液等量混合封片?
(3)免疫酶染色中的3%过氧化氢及2N盐酸是否还需要用?
参考见解:
(1)你的二抗是用FITC标记的，为避免荧光分解，分装及荧光显微镜观察时均要避光;
(2)封片最好用甘油加0.5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氢盐缓冲液，后者能使玻片透明;
(3)关于免疫酶染色，如果是用过氧化物酶做标记，就必须用3%H2O2以去除内源性过氧化物酶;2N盐酸需要使用，目的是使DNA变性，让Brdu抗体能够充分地与已经掺入的Brdu结合。
4、问:做间接法免疫荧光染色，如何设置对照?
参考见解:最好是同一视野在未用荧光激发下进行对照，看是否非特异性染色。
(1)空白对照:如果你做的是石蜡切片免疫组化，这个对照必须有，目的是看自发荧光，脱蜡后直接在荧光显微镜下观察。
(2)阴性对照:标本直接滴加二抗，呈阴性反应。
(3)抗原对照:标本加同种动物的未免疫血清，以PBS冲洗后，在加抗免疫球蛋白荧光抗体。因未免疫动物的血清中无特异性抗体，应呈阴性反应。
5、问:我做乳腺组织的免疫荧光染色，结果用激光共聚焦显微镜看很好:有阳性信号，阴性对照组也没有荧光，但是拿到荧光显微镜下看，我的阴性对照组一片绿，像非特异性染色，到底哪个结果才是真实的呢?
参考见解:激光共聚焦显微镜的分辨率比普通荧光显微镜要高的多，出现上述现象首先要排除荧光显微镜的问题，如是不是紫外灯泡寿命到期了或者别的原因，荧光显微镜没有问题，那就以共聚焦显微镜的结果为主。展开
参考见解:只是固定方法不同。细胞固定用甲醇，切片固定用多聚甲醛，而染色方法是一样的。
2、问:近期要做免疫荧光双标，不知哪位有免疫荧光双标技术的详细步骤及其注意事项?
参考见解:我正在做冰冻组织切片的免疫荧光双染。我的经验是:
(1)选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。
(2)我的做法是两种一抗（CHI抗体）同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。
(3)我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。
(4)封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey血清。
(5)其余步骤同一般免疫荧光单标操作。
3、问:本人拟做Brdu标记神经干细胞免疫荧光，二抗为FITC标记，想请教各位大侠:
(1)抗体分装和荧光显微镜观察时是否一定要在暗室中进行?
(2)封片时是否用甘油缓冲液即可，还是用甘油和0.5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氢盐缓冲液等量混合封片?
(3)免疫酶染色中的3%过氧化氢及2N盐酸是否还需要用?
参考见解:
(1)你的二抗是用FITC标记的，为避免荧光分解，分装及荧光显微镜观察时均要避光;
(2)封片最好用甘油加0.5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氢盐缓冲液，后者能使玻片透明;
(3)关于免疫酶染色，如果是用过氧化物酶做标记，就必须用3%H2O2以去除内源性过氧化物酶;2N盐酸需要使用，目的是使DNA变性，让Brdu抗体能够充分地与已经掺入的Brdu结合。
4、问:做间接法免疫荧光染色，如何设置对照?
参考见解:最好是同一视野在未用荧光激发下进行对照，看是否非特异性染色。
(1)空白对照:如果你做的是石蜡切片免疫组化，这个对照必须有，目的是看自发荧光，脱蜡后直接在荧光显微镜下观察。
(2)阴性对照:标本直接滴加二抗，呈阴性反应。
(3)抗原对照:标本加同种动物的未免疫血清，以PBS冲洗后，在加抗免疫球蛋白荧光抗体。因未免疫动物的血清中无特异性抗体，应呈阴性反应。
5、问:我做乳腺组织的免疫荧光染色，结果用激光共聚焦显微镜看很好:有阳性信号，阴性对照组也没有荧光，但是拿到荧光显微镜下看，我的阴性对照组一片绿，像非特异性染色，到底哪个结果才是真实的呢?
参考见解:激光共聚焦显微镜的分辨率比普通荧光显微镜要高的多，出现上述现象首先要排除荧光显微镜的问题，如是不是紫外灯泡寿命到期了或者别的原因，荧光显微镜没有问题，那就以共聚焦显微镜的结果为主。展开
ELISPOT步骤123
天之饺子2003-11-21
1预期用途
Eli-spot分析是设计用于在单细胞悬液中计数分泌细胞因子的细胞数量的方法。这个方法的优点在于只需在体外进行很少的处理从而使细胞因子产生的分析尽可能接近于体内状况。这个技术用于测定在给予一定刺激的情况下细胞因子产生细胞的数目，以及在某种处理或病理条件下的细胞因子产生细胞的数量。
2主要原理
细胞刺激后，原位产生的细胞因子被一种特异的单抗捕获，在细胞溶解后，捕获的细胞因子与第二种生物素化的检测性抗体结合，后者进一步通过与连接碱性磷酸酶的链亲和素结合被识别。PVDF包被孔的板之后与BCIP/NBT底物作用，紫色的斑点提示单个细胞产生的细胞因子。
35×96孔试剂盒的内容物
▲捕获抗体（0.52ml），置于4℃。
▲生物素化检测抗体（冻干，重悬于0.55ml水中）。
▲抗生物素蛋白链霉素-碱性磷酸酶结合物，置于4℃。
▲牛血清白蛋白（1g），置于4℃。
▲撇去的干牛奶（1g），放于室温。
▲备用底物溶液（50ml），置于4℃。
▲96孔PVDF包被板。
▲96孔PVDF-包被板
▲细胞培养基
▲CO2孵箱
▲70%乙醇
▲Tween20
▲碱性磷酸盐缓冲液
5直接或间接Eli-spot
细胞可以在抗体包被孔中直接刺激（直接）或者首先在24孔板或细颈瓶中刺激，收获，然后种于包被孔中（间接）。
方法根据：1）被分析的细胞类型；2）预期的细胞密度。如果细胞因子产生细胞的数量很少，建议用直接法实验，但是如果细胞因子产生细胞的数量很多，最好用间接的方法。无论采用直接或间接的方法，所有刺激以后的步骤是相同的。
主要步骤：
1）96孔PVDF板首先以70%乙醇处理，然后以捕获抗体包被。
2）将细胞放入抗体包被过的含有抗原/丝裂原的微孔中，在间接法中细胞被预刺激。
3）细胞用倒置平板法去除，与生物素标记的抗体共育。
4）与结合于碱性磷酸盐的链霉亲和素反应。
5）BCIP/NTB斑点形成。
◆刺激步骤：
小鼠脾细胞在PMA和lonomycin刺激下产生IFN-γ。人的IFN-γ由PBMC在PMA和lonomycin的刺激下产生。
建议步骤：
小鼠1）分离脾细胞，ficoll。间期收获细胞。用PBS洗三次，去除ficoll。2）用培养基稀释细胞（RPMI1640含2mML_glutamine,10%灭活的胎牛血清）含1ng/mlPMA和500ng/mlionomycin(Sigma),加2×10（4）—5×10（4）细胞到抗体包被的PVDF包被板，在孵箱中培养10—15小时。对于其它刺激物孵育时间可能不同，根据细胞因子产生细胞的密度，优化条件。
人用培养基稀释细胞（RPMI1640含2mML_glutamine,10%灭活的胎牛血清）含1ng/mlPMA和500ng/mlionomycin(Sigma),加2×10（4）—5×10（4）细胞到抗体包被的PVDF包被板，在孵箱中培养10—15小时。对于其它刺激物孵育时间可能不同，根据细胞因子产生细胞的密度，优化条件。
●试剂准备
●检测抗体用0.55ml蒸馏水溶解冻干抗体，轻轻混匀溶液并等到所有冻干抗体溶解。
●抗生物素蛋白链霉素-碱性磷酸酶用含1%BSA的PBS稀释（1/1000）
●碱性磷酸盐缓冲液（10×浓缩液）
1L溶液：80gNaCL；2gKH2PO4;14.4gNa2HPO42H2O;2gKCL，加蒸馏水至1升。检查PH在7.2-7.4之间，此溶液在用之前稀释为1×溶液。
●含2%脱脂干奶粉的PBS一块板溶0.2g干粉于10ml1×PBS。
●含1%BSA的PBS一块板溶0.2g干粉于20ml1×PBS。
●含0.1%Tween的PBS一块板溶100μlTween20于100ml1×PBS。
●70%乙醇一块板以3ml蒸馏水和7ml乙醇混匀。
★试剂保存
1）如果短时间内不用，溶解的检测抗体应分装和保存于—20℃，在这种条件下，试剂可稳定保存至少一年。
2）底物缓冲液保存于4℃。
3）链霉亲和素-碱性磷酸酶保存于4℃。
Eli-spot步骤
1PVDF包被板用100ul70%乙醇室温下处理10分钟。
2倒空孔并以100ulPBS洗3次。
3将100ul捕获抗体加到10mlPBS中，混合并分至每孔中100ul，盖上板盖，放至4℃过夜。
4倒空每孔，用100ulPBS洗一次。
5每孔加100ul含2%脱脂干牛奶的PBS，盖板，室温2小时。
6在洗涤槽上轻弹板子倒空液体，并在吸水纸上吸干。
7用PBS洗一次。
8分配每孔100ul细胞悬液（含合适的细胞数和合适的刺激物浓度），细胞可以在体外预刺激（间接Eli-spot）。盖上板，放细胞于37℃CO2孵箱，合适的时间15-20小时。（在此期间不要摇动或平移平板。）
9在洗涤槽上轻弹板子倒空液体，并在吸水纸上吸干。
10每孔加100ul含0.1%Tween20的PBS，4℃放置10分钟。
11用含0.1%Tween20的PBS洗板三次。
12每一块板，稀释100ul检测抗体到10ml含1%BSA的PBS中，每孔加100ul，封闭扳子放于37℃1小时30分钟。
13倒空扳子并用含0.1%Tween20的PBS洗三次。
14每一块板，稀释10ul链霉亲和素-碱性磷酸酶复合物到10ml含1%BSA的PBS中，每孔加100ul，封闭扳子放于37℃1小时。
15倒空，用含0.1%Tween20的PBS洗三遍，反复用吸水纸吸以去尽所有残存的液体。
16每孔加100ul备用BCIP/NBT溶液。
17让反应在室温进行5-20分钟。肉眼可见小斑点形成。
18用蒸馏水洗三次。
19干燥每孔。计数斑点。注意斑点在4℃过夜后可能会变得明显，放置扳子于室温，避免直接光照。
Eli-spot分析是设计用于在单细胞悬液中计数分泌细胞因子的细胞数量的方法。这个方法的优点在于只需在体外进行很少的处理从而使细胞因子产生的分析尽可能接近于体内状况。这个技术用于测定在给予一定刺激的情况下细胞因子产生细胞的数目，以及在某种处理或病理条件下的细胞因子产生细胞的数量。
2主要原理
细胞刺激后，原位产生的细胞因子被一种特异的单抗捕获，在细胞溶解后，捕获的细胞因子与第二种生物素化的检测性抗体结合，后者进一步通过与连接碱性磷酸酶的链亲和素结合被识别。PVDF包被孔的板之后与BCIP/NBT底物作用，紫色的斑点提示单个细胞产生的细胞因子。
35×96孔试剂盒的内容物
▲捕获抗体（0.52ml），置于4℃。
▲生物素化检测抗体（冻干，重悬于0.55ml水中）。
▲抗生物素蛋白链霉素-碱性磷酸酶结合物，置于4℃。
▲牛血清白蛋白（1g），置于4℃。
▲撇去的干牛奶（1g），放于室温。
▲备用底物溶液（50ml），置于4℃。
▲96孔PVDF包被板。
▲96孔PVDF-包被板
▲细胞培养基
▲CO2孵箱
▲70%乙醇
▲Tween20
▲碱性磷酸盐缓冲液
5直接或间接Eli-spot
细胞可以在抗体包被孔中直接刺激（直接）或者首先在24孔板或细颈瓶中刺激，收获，然后种于包被孔中（间接）。
方法根据：1）被分析的细胞类型；2）预期的细胞密度。如果细胞因子产生细胞的数量很少，建议用直接法实验，但是如果细胞因子产生细胞的数量很多，最好用间接的方法。无论采用直接或间接的方法，所有刺激以后的步骤是相同的。
主要步骤：
1）96孔PVDF板首先以70%乙醇处理，然后以捕获抗体包被。
2）将细胞放入抗体包被过的含有抗原/丝裂原的微孔中，在间接法中细胞被预刺激。
3）细胞用倒置平板法去除，与生物素标记的抗体共育。
4）与结合于碱性磷酸盐的链霉亲和素反应。
5）BCIP/NTB斑点形成。
◆刺激步骤：
小鼠脾细胞在PMA和lonomycin刺激下产生IFN-γ。人的IFN-γ由PBMC在PMA和lonomycin的刺激下产生。
建议步骤：
小鼠1）分离脾细胞，ficoll。间期收获细胞。用PBS洗三次，去除ficoll。2）用培养基稀释细胞（RPMI1640含2mML_glutamine,10%灭活的胎牛血清）含1ng/mlPMA和500ng/mlionomycin(Sigma),加2×10（4）—5×10（4）细胞到抗体包被的PVDF包被板，在孵箱中培养10—15小时。对于其它刺激物孵育时间可能不同，根据细胞因子产生细胞的密度，优化条件。
人用培养基稀释细胞（RPMI1640含2mML_glutamine,10%灭活的胎牛血清）含1ng/mlPMA和500ng/mlionomycin(Sigma),加2×10（4）—5×10（4）细胞到抗体包被的PVDF包被板，在孵箱中培养10—15小时。对于其它刺激物孵育时间可能不同，根据细胞因子产生细胞的密度，优化条件。
●试剂准备
●检测抗体用0.55ml蒸馏水溶解冻干抗体，轻轻混匀溶液并等到所有冻干抗体溶解。
●抗生物素蛋白链霉素-碱性磷酸酶用含1%BSA的PBS稀释（1/1000）
●碱性磷酸盐缓冲液（10×浓缩液）
1L溶液：80gNaCL；2gKH2PO4;14.4gNa2HPO42H2O;2gKCL，加蒸馏水至1升。检查PH在7.2-7.4之间，此溶液在用之前稀释为1×溶液。
●含2%脱脂干奶粉的PBS一块板溶0.2g干粉于10ml1×PBS。
●含1%BSA的PBS一块板溶0.2g干粉于20ml1×PBS。
●含0.1%Tween的PBS一块板溶100μlTween20于100ml1×PBS。
●70%乙醇一块板以3ml蒸馏水和7ml乙醇混匀。
★试剂保存
1）如果短时间内不用，溶解的检测抗体应分装和保存于—20℃，在这种条件下，试剂可稳定保存至少一年。
2）底物缓冲液保存于4℃。
3）链霉亲和素-碱性磷酸酶保存于4℃。
Eli-spot步骤
1PVDF包被板用100ul70%乙醇室温下处理10分钟。
2倒空孔并以100ulPBS洗3次。
3将100ul捕获抗体加到10mlPBS中，混合并分至每孔中100ul，盖上板盖，放至4℃过夜。
4倒空每孔，用100ulPBS洗一次。
5每孔加100ul含2%脱脂干牛奶的PBS，盖板，室温2小时。
6在洗涤槽上轻弹板子倒空液体，并在吸水纸上吸干。
7用PBS洗一次。
8分配每孔100ul细胞悬液（含合适的细胞数和合适的刺激物浓度），细胞可以在体外预刺激（间接Eli-spot）。盖上板，放细胞于37℃CO2孵箱，合适的时间15-20小时。（在此期间不要摇动或平移平板。）
9在洗涤槽上轻弹板子倒空液体，并在吸水纸上吸干。
10每孔加100ul含0.1%Tween20的PBS，4℃放置10分钟。
11用含0.1%Tween20的PBS洗板三次。
12每一块板，稀释100ul检测抗体到10ml含1%BSA的PBS中，每孔加100ul，封闭扳子放于37℃1小时30分钟。
13倒空扳子并用含0.1%Tween20的PBS洗三次。
14每一块板，稀释10ul链霉亲和素-碱性磷酸酶复合物到10ml含1%BSA的PBS中，每孔加100ul，封闭扳子放于37℃1小时。
15倒空，用含0.1%Tween20的PBS洗三遍，反复用吸水纸吸以去尽所有残存的液体。
16每孔加100ul备用BCIP/NBT溶液。
17让反应在室温进行5-20分钟。肉眼可见小斑点形成。
18用蒸馏水洗三次。
19干燥每孔。计数斑点。注意斑点在4℃过夜后可能会变得明显，放置扳子于室温，避免直接光照。
【求助】一抗是羊抗鼠的,二抗必须用驴抗羊吗? 免疫学讨论版...123
猫隐丶隹悤2021-07-31
如果是单标兔抗羊跟驴抗羊无所谓，只是注意封闭血清跟二抗来源相同就行。但如果是双标，就要考虑到二抗种属问题了
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