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Anticorps monoclonal anti-CD62P, clone LYP20, purifié
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| Référence | 5111-P |
|---|---|
| Statut | RUO |
| Quantité | 0,1mg |
| Type | Monoclonal |
| Antigène et Synonyme | P-selectin, GMP140, PADGEM, LECAM-3 |
| Clone | LYP20 |
| Isotype | IgG1, Kappa |
| Volume | 1 ml |
| Réactivité | Humain, Réactivité croisée avec le rat |
| Immunogène | Plaquettes traitées par la Chymotrypsine |
| Hôte | Souris |
| Application | Pour plus d"informations, consulter la page Téléchargement. |
| Composition | PBS-BSA 0.1%, Sodium Azide 0.09% |
Anticorps monoclonal anti-CD62P, clone LYP20, purifié
| Date | Nom du document | Taille du fichier | Télécharger |
|---|---|---|---|
| 01/03/2005 | Package insert CD62P | -9.48 Ko | Télécharger |
| Titre | Référence |
|---|---|
| Anticorps monoclonal anti-CD62P, clone LYP20, conjugué FITC | 5111-F100T |
| Anticorps monoclonal anti-CD62P, clone LYP20, conjugé R-PE | 5111-PE100T |
| PLATELET Calibrator | 7011 |
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艾美捷科技有限公司在发布的SPRD荧光标记Streptavidin链霉亲和素(0.1 mg) | Streptavidin-SPRD供应信息，浏览与SPRD荧光标记Streptavidin链霉亲和素(0.1 mg) | Streptavidin-SPRD相关的产品或在搜索更多与SPRD荧光标记Streptavidin链霉亲和素(0.1 mg) | Streptavidin-SPRD相关的内容。 查看更多
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2021-08-23
胰腺癌是种相对少见的癌症，发病率约占所有癌症的3%，据估计，全球每年确诊的胰腺癌病例超过33.7万，在美国，2018年胰腺癌的发病人数预计有5.5万。虽然发病率不高，但胰腺癌的侵袭 查看更多
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2020-03-03
上海甄准生物科技有限公司在发布的链霉亲和素包被的聚苯乙烯微球，可用于化学发光分析—上海甄准供应信息，浏览与链霉亲和素包被的聚苯乙烯微球，可用于化学发光分析—上海甄准相关的产品或在搜索更多与链霉亲和素包被的聚苯乙烯微球，可用于化学发光分析—上海甄准相关的内容。 查看更多
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2018-07-11
上海榕柏生物技术有限公司在发布的Getein1100荧光免疫定量分析仪 检验科用仪器供应信息，浏览与Getein1100荧光免疫定量分析仪 检验科用仪器相关的产品或在搜索更多与Getein1100荧光免疫定量分析仪 检验科用仪器相关的内容。 查看更多
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2019-05-27
北京百智生物科技有限公司在发布的碱性磷酸酶标记的链霉亲和素供应信息，浏览与碱性磷酸酶标记的链霉亲和素相关的产品或在搜索更多与碱性磷酸酶标记的链霉亲和素相关的内容。 查看更多
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2018-07-15
【免疫组织化学IHC】生物实验,分子生物学实验技术,BIOLEAF.实验技术服务 tosciencebio@126.com 选实验技术服务，还在上海通善。 您的选择，就是对我们公司的肯定。 相信通善，相信自己，我们有太多优势，让您在众多信息流中独具慧眼的找到我们。【免疫组织化学IHC】生物实验,分子生物学实验技术,BIOLEAF.实验技术服务 tosciencebio@126.com 一，通善的服务与态度 公司的宗旨是以更高的品质、 查看更多
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2021-07-26
杭州中翰盛泰医疗器械有限公司在发布的β-人绒毛膜促性腺激素测定试剂盒（免疫荧光干式定量法）供应信息，浏览与β-人绒毛膜促性腺激素测定试剂盒（免疫荧光干式定量法）相关的产品或在搜索更多与β-人绒毛膜促性腺激素测定试剂盒（免疫荧光干式定量法）相关的内容。 查看更多
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2021-08-20
荧光素AlexaFluor555标记链霉亲和素Streptavidin/AF55557532北京博奥森生物技术有限公司荧光素Alexa Fluor 555标记链霉亲和素 查看更多
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2021-09-08
上海信裕生物科技有限公司在发布的Peroxidase-conjugated Streptavidin辣根过氧化物酶标记链霉亲和素供应信息，浏览与Peroxidase-conjugated Streptavidin辣根过氧化物酶标记链霉亲和素相关的产品或在搜索更多与Peroxidase-conjugated Streptavidin辣根过氧化物酶标记链霉亲和素相关的内容。 查看更多
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2021-07-30
碱性磷酸酶标记链霉亲和素Streptavidin/AP57532北京博奥森生物技术有限公司碱性磷酸酶标记链霉亲和素 查看更多
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2018-05-23
植物S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（SAMDC）酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于测定植物组织、细胞及相关液体样本中S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（SAMDC）的含量。 实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中植物S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（SAMDC）水平。用纯化的植物S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（SAMDC）捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入植物S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（SAM 查看更多
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2021-09-13
中科晨宇（北京）贸易有限公司在发布的鸡血清蛋白（冻干粉）供应信息，浏览与鸡血清蛋白（冻干粉）相关的产品或在搜索更多与鸡血清蛋白（冻干粉）相关的内容。 查看更多
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如何降低ELISA的背景_文章123
liuhua2018-01-30
ELISA实验的原理似乎很简单，不外乎固定抗原，添加一抗、二抗和底物，间中夹杂着洗涤和封闭。然而，即使是平淡无奇的洗涤和封闭，如果做得不太好，也有可能毁了整个实验。在实验结束时，我们是否能获得有意义的信息，这在很大程度上取决于结果的信噪比。背景噪音会影响您对结果的判断。如何降低ELISA的背景，下面有一些tips。洗涤很重要
洗涤步骤看似很无聊，其实很重要，因为如果未结合的材料（如非特异结合的抗体或检测试剂）残留在微孔板中，那么它会增加背景噪音。如有必要，可增加洗涤液中的盐浓度，这会阻止非特异结合反应。如果背景过高，而您怀疑洗涤不够时，可以尝试增加洗涤次数。封闭更关键
封闭液的作用是让不相关的蛋白占据微孔板中潜在的结合位点。这就降低了可产生信号的抗体非特异结合的机会。您当然也希望抗体只与目的蛋白结合吧。如果您的背景过高，怀疑封闭不充分，那么您可以尝试使用更高浓度的封闭液，或适当延长封闭时间。如果您一直被背景问题所困扰，那么也许您该花些时间来优化封闭液。这可能需要时间，但也是值得的。目前主要有两种类型的封闭液：蛋白和非离子型去污剂。您使用的类型须取决于多个因素，包括微孔板的表面试剂、吸附的抗原、您的抗体和检测试剂。好的封闭液应降低非特异性结合，但它不应当与抗原、抗体或检测试剂发生相互作用。
最常用的非离子型去污剂是Tween-20。这种封闭液便宜、稳定，在去除洗涤过程中的一些非特异结合上很有用。但它们只在存在时起作用，因为很容易被洗掉。因此所有洗涤液中也必须添加封闭液。请勿使用高浓度（正常浓度为0.01-0.1%），它会降低特异结合，产生假阴性。另一个选择是使用蛋白和非离子型去污剂这两种封闭液，后者可协助洗涤过程中的封闭。蛋白封闭液则有所不同，是永久的。它们与开放位点结合并封闭，同时稳定与微孔板结合的抗原分子。常用的蛋白封闭液包括牛血清白蛋白（BSA）、脱脂奶粉、正常血清和鱼明胶。血清组分的内在多样性可使它有效拦截许多不同类型的分子相互作用。不过，它的缺点在于能与Protein A和IgG抗体相互作用。解决这个问题的一种方法是使用鸡或鱼的正常血清。
抗体浓度须优化我们通常会follow师兄师姐留下来的操作步骤，但是如果试剂稍有不同，则可能需要优化抗体的量。记住，非特异的抗体结合会增加背景。为了防止这一点，切勿使用过多的一抗或二抗。
洗涤步骤看似很无聊，其实很重要，因为如果未结合的材料（如非特异结合的抗体或检测试剂）残留在微孔板中，那么它会增加背景噪音。如有必要，可增加洗涤液中的盐浓度，这会阻止非特异结合反应。如果背景过高，而您怀疑洗涤不够时，可以尝试增加洗涤次数。封闭更关键
封闭液的作用是让不相关的蛋白占据微孔板中潜在的结合位点。这就降低了可产生信号的抗体非特异结合的机会。您当然也希望抗体只与目的蛋白结合吧。如果您的背景过高，怀疑封闭不充分，那么您可以尝试使用更高浓度的封闭液，或适当延长封闭时间。如果您一直被背景问题所困扰，那么也许您该花些时间来优化封闭液。这可能需要时间，但也是值得的。目前主要有两种类型的封闭液：蛋白和非离子型去污剂。您使用的类型须取决于多个因素，包括微孔板的表面试剂、吸附的抗原、您的抗体和检测试剂。好的封闭液应降低非特异性结合，但它不应当与抗原、抗体或检测试剂发生相互作用。
最常用的非离子型去污剂是Tween-20。这种封闭液便宜、稳定，在去除洗涤过程中的一些非特异结合上很有用。但它们只在存在时起作用，因为很容易被洗掉。因此所有洗涤液中也必须添加封闭液。请勿使用高浓度（正常浓度为0.01-0.1%），它会降低特异结合，产生假阴性。另一个选择是使用蛋白和非离子型去污剂这两种封闭液，后者可协助洗涤过程中的封闭。蛋白封闭液则有所不同，是永久的。它们与开放位点结合并封闭，同时稳定与微孔板结合的抗原分子。常用的蛋白封闭液包括牛血清白蛋白（BSA）、脱脂奶粉、正常血清和鱼明胶。血清组分的内在多样性可使它有效拦截许多不同类型的分子相互作用。不过，它的缺点在于能与Protein A和IgG抗体相互作用。解决这个问题的一种方法是使用鸡或鱼的正常血清。
抗体浓度须优化我们通常会follow师兄师姐留下来的操作步骤，但是如果试剂稍有不同，则可能需要优化抗体的量。记住，非特异的抗体结合会增加背景。为了防止这一点，切勿使用过多的一抗或二抗。
HemoGenix品牌简介 HemoGenix 干细胞;流式细胞仪;细胞 ...123
liking9432018-01-30
封闭不当反而会使阴性本底增高，操作时洗涤彻底，取决于 ELISA 的模式及具体的实验条件，业已起到了类似封闭剂的作用.5%的牛血清白蛋白，封闭一般是不可少的(见2，而且封闭后的载体不易长期保存，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙 。特别是用单抗腹水直接包被时。高质量的速溶食用低脂奶粉即可直接当作封闭剂使用。 BIM试剂盒为您提供.2。脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，双抗体夹心法。抗原或抗体包被时所用的浓度较低.05%-0。包被好的E LISA 板干燥后放入密封袋或锡袋中，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，因其中大量非抗体蛋白在包被时同样也吸附在固相表面，从而排斥在ELISA 其后的步骤中干扰物质的再吸附。但在间接法测定中; ，因此在试剂盒的制备中较少应用; ，在低温可保存数月。一般说来，其最大的特点是价廉。并非所有的ELISA 固相均需封闭，也有用10%的小牛血清或1%明胶作为封闭剂的，可以高浓度使用(5%)。封闭的手续与包被相类似; 。最常用的封闭剂是0，不经封闭也可得到满意的结果;封闭 (blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程，但由于奶粉的成份复杂.2)。封闭是否必要，只要酶标记物是高活性的
免疫组化实验时已经用血清封闭了还可以再次透膜吗?对封闭的位点会有...123
asiar20102018-01-30
不可以。透膜也好，酶消化也好，抗原热修复也好，消除内源性过氧化物酶和内源性生物素也好，都要在血清封闭之前，如果你忘记了前面的步骤，可以洗去封闭液，补上必须的程序，再封闭，不洗，吸干封闭液直接加一抗。
一抗孵育时间 搜索123
椃棜L2018-02-10
1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时.
2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟
3.PBS洗净:3min*3
4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS
5.PBS洗净:2*5min
6.羊血清封闭：37度，20分钟
7.一抗，4度过夜，一般要大于18小时或者37度 1-2小时
8.4度 PBS洗净，3min*5次
9.二抗 37度小于一小时
2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟
3.PBS洗净:3min*3
4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS
5.PBS洗净:2*5min
6.羊血清封闭：37度，20分钟
7.一抗，4度过夜，一般要大于18小时或者37度 1-2小时
8.4度 PBS洗净，3min*5次
9.二抗 37度小于一小时
Toagosei Co Ltd(4045)股票行情走势技术分析_未来预测_买卖操作...123
熬夜爱陆JUii02021-07-21
可以使用无蛋白封闭液 PW040 PW041 PW042，
血清封闭：组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性；封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。
血清封闭：组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性；封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。
免疫组化中的血清封闭原理 实验方法123
林子哥902018-01-14
封闭是血清与非特异性位点结合，以消除非特异性染色，提高目的蛋白的准确性和降低背景。并非所有的免疫组化都由山羊血清封闭，因为一般二抗是羊抗X，所以采用山羊血清，其与使用二抗来源有关。
利用生物信息学数据及工具合成表达链霉亲和素基因123
2021-07-26
你可以去http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/查找你需要的序列，你要的那个基因有许多，你自己挑挑看哪个是你要的。
细胞培养时要用无血清培养基,为何还要加FBS 细胞技术讨论版...123
n1e247J2018-02-05
牛血清白蛋白（BSA），又称第五组分，是牛血清中的一种白蛋白在酶切反应缓冲液中加入BSA，通过提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护作用。防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻有些酶的变性，能减轻有些不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性。
牛血清白蛋白（BSA）用途：
1、 在酶切反应缓冲液中加入BSA，通过提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护作用。防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻有些酶的变性，减轻不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性的。
2 、ELISA中也常常用到，比如封闭液，样本稀释液，酶结合物稀释液都可以用BSA。
3、生化研究，遗传工程和药物研究。
胎牛血清（fbs）是一种性状、外观 浅黄色澄清、无溶血、无异物稍粘稠液体。
胎牛血清(FBS)的作用：
1、提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。
2、提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调变它们所结合的物质活力。
3、有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用。
4、是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。
5、起酸碱度缓冲液作用。
6、提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。展开
牛血清白蛋白（BSA）用途：
1、 在酶切反应缓冲液中加入BSA，通过提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护作用。防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻有些酶的变性，减轻不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性的。
2 、ELISA中也常常用到，比如封闭液，样本稀释液，酶结合物稀释液都可以用BSA。
3、生化研究，遗传工程和药物研究。
胎牛血清（fbs）是一种性状、外观 浅黄色澄清、无溶血、无异物稍粘稠液体。
胎牛血清(FBS)的作用：
1、提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。
2、提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调变它们所结合的物质活力。
3、有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用。
4、是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。
5、起酸碱度缓冲液作用。
6、提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。展开
another吧3年3組集合∠(= ?ω?=)/纯爱?灵异?推理?校园...123
2021-07-29
封闭用驴血清，不要太贵的，进口的那些实在是太贵，一两千，但是现在又急用，哪里有现货啊？？做免疫荧光，一般的驴血清行不？还是必须要封闭驴血清。急啊！请大家告知！
ELISPOT步骤123
天之饺子2003-11-21
1预期用途
Eli-spot分析是设计用于在单细胞悬液中计数分泌细胞因子的细胞数量的方法。这个方法的优点在于只需在体外进行很少的处理从而使细胞因子产生的分析尽可能接近于体内状况。这个技术用于测定在给予一定刺激的情况下细胞因子产生细胞的数目，以及在某种处理或病理条件下的细胞因子产生细胞的数量。
2主要原理
细胞刺激后，原位产生的细胞因子被一种特异的单抗捕获，在细胞溶解后，捕获的细胞因子与第二种生物素化的检测性抗体结合，后者进一步通过与连接碱性磷酸酶的链亲和素结合被识别。PVDF包被孔的板之后与BCIP/NBT底物作用，紫色的斑点提示单个细胞产生的细胞因子。
35×96孔试剂盒的内容物
▲捕获抗体（0.52ml），置于4℃。
▲生物素化检测抗体（冻干，重悬于0.55ml水中）。
▲抗生物素蛋白链霉素-碱性磷酸酶结合物，置于4℃。
▲牛血清白蛋白（1g），置于4℃。
▲撇去的干牛奶（1g），放于室温。
▲备用底物溶液（50ml），置于4℃。
▲96孔PVDF包被板。
▲96孔PVDF-包被板
▲细胞培养基
▲CO2孵箱
▲70%乙醇
▲Tween20
▲碱性磷酸盐缓冲液
5直接或间接Eli-spot
细胞可以在抗体包被孔中直接刺激（直接）或者首先在24孔板或细颈瓶中刺激，收获，然后种于包被孔中（间接）。
方法根据：1）被分析的细胞类型；2）预期的细胞密度。如果细胞因子产生细胞的数量很少，建议用直接法实验，但是如果细胞因子产生细胞的数量很多，最好用间接的方法。无论采用直接或间接的方法，所有刺激以后的步骤是相同的。
主要步骤：
1）96孔PVDF板首先以70%乙醇处理，然后以捕获抗体包被。
2）将细胞放入抗体包被过的含有抗原/丝裂原的微孔中，在间接法中细胞被预刺激。
3）细胞用倒置平板法去除，与生物素标记的抗体共育。
4）与结合于碱性磷酸盐的链霉亲和素反应。
5）BCIP/NTB斑点形成。
◆刺激步骤：
小鼠脾细胞在PMA和lonomycin刺激下产生IFN-γ。人的IFN-γ由PBMC在PMA和lonomycin的刺激下产生。
建议步骤：
小鼠1）分离脾细胞，ficoll。间期收获细胞。用PBS洗三次，去除ficoll。2）用培养基稀释细胞（RPMI1640含2mML_glutamine,10%灭活的胎牛血清）含1ng/mlPMA和500ng/mlionomycin(Sigma),加2×10（4）—5×10（4）细胞到抗体包被的PVDF包被板，在孵箱中培养10—15小时。对于其它刺激物孵育时间可能不同，根据细胞因子产生细胞的密度，优化条件。
人用培养基稀释细胞（RPMI1640含2mML_glutamine,10%灭活的胎牛血清）含1ng/mlPMA和500ng/mlionomycin(Sigma),加2×10（4）—5×10（4）细胞到抗体包被的PVDF包被板，在孵箱中培养10—15小时。对于其它刺激物孵育时间可能不同，根据细胞因子产生细胞的密度，优化条件。
●试剂准备
●检测抗体用0.55ml蒸馏水溶解冻干抗体，轻轻混匀溶液并等到所有冻干抗体溶解。
●抗生物素蛋白链霉素-碱性磷酸酶用含1%BSA的PBS稀释（1/1000）
●碱性磷酸盐缓冲液（10×浓缩液）
1L溶液：80gNaCL；2gKH2PO4;14.4gNa2HPO42H2O;2gKCL，加蒸馏水至1升。检查PH在7.2-7.4之间，此溶液在用之前稀释为1×溶液。
●含2%脱脂干奶粉的PBS一块板溶0.2g干粉于10ml1×PBS。
●含1%BSA的PBS一块板溶0.2g干粉于20ml1×PBS。
●含0.1%Tween的PBS一块板溶100μlTween20于100ml1×PBS。
●70%乙醇一块板以3ml蒸馏水和7ml乙醇混匀。
★试剂保存
1）如果短时间内不用，溶解的检测抗体应分装和保存于—20℃，在这种条件下，试剂可稳定保存至少一年。
2）底物缓冲液保存于4℃。
3）链霉亲和素-碱性磷酸酶保存于4℃。
Eli-spot步骤
1PVDF包被板用100ul70%乙醇室温下处理10分钟。
2倒空孔并以100ulPBS洗3次。
3将100ul捕获抗体加到10mlPBS中，混合并分至每孔中100ul，盖上板盖，放至4℃过夜。
4倒空每孔，用100ulPBS洗一次。
5每孔加100ul含2%脱脂干牛奶的PBS，盖板，室温2小时。
6在洗涤槽上轻弹板子倒空液体，并在吸水纸上吸干。
7用PBS洗一次。
8分配每孔100ul细胞悬液（含合适的细胞数和合适的刺激物浓度），细胞可以在体外预刺激（间接Eli-spot）。盖上板，放细胞于37℃CO2孵箱，合适的时间15-20小时。（在此期间不要摇动或平移平板。）
9在洗涤槽上轻弹板子倒空液体，并在吸水纸上吸干。
10每孔加100ul含0.1%Tween20的PBS，4℃放置10分钟。
11用含0.1%Tween20的PBS洗板三次。
12每一块板，稀释100ul检测抗体到10ml含1%BSA的PBS中，每孔加100ul，封闭扳子放于37℃1小时30分钟。
13倒空扳子并用含0.1%Tween20的PBS洗三次。
14每一块板，稀释10ul链霉亲和素-碱性磷酸酶复合物到10ml含1%BSA的PBS中，每孔加100ul，封闭扳子放于37℃1小时。
15倒空，用含0.1%Tween20的PBS洗三遍，反复用吸水纸吸以去尽所有残存的液体。
16每孔加100ul备用BCIP/NBT溶液。
17让反应在室温进行5-20分钟。肉眼可见小斑点形成。
18用蒸馏水洗三次。
19干燥每孔。计数斑点。注意斑点在4℃过夜后可能会变得明显，放置扳子于室温，避免直接光照。
Eli-spot分析是设计用于在单细胞悬液中计数分泌细胞因子的细胞数量的方法。这个方法的优点在于只需在体外进行很少的处理从而使细胞因子产生的分析尽可能接近于体内状况。这个技术用于测定在给予一定刺激的情况下细胞因子产生细胞的数目，以及在某种处理或病理条件下的细胞因子产生细胞的数量。
2主要原理
细胞刺激后，原位产生的细胞因子被一种特异的单抗捕获，在细胞溶解后，捕获的细胞因子与第二种生物素化的检测性抗体结合，后者进一步通过与连接碱性磷酸酶的链亲和素结合被识别。PVDF包被孔的板之后与BCIP/NBT底物作用，紫色的斑点提示单个细胞产生的细胞因子。
35×96孔试剂盒的内容物
▲捕获抗体（0.52ml），置于4℃。
▲生物素化检测抗体（冻干，重悬于0.55ml水中）。
▲抗生物素蛋白链霉素-碱性磷酸酶结合物，置于4℃。
▲牛血清白蛋白（1g），置于4℃。
▲撇去的干牛奶（1g），放于室温。
▲备用底物溶液（50ml），置于4℃。
▲96孔PVDF包被板。
▲96孔PVDF-包被板
▲细胞培养基
▲CO2孵箱
▲70%乙醇
▲Tween20
▲碱性磷酸盐缓冲液
5直接或间接Eli-spot
细胞可以在抗体包被孔中直接刺激（直接）或者首先在24孔板或细颈瓶中刺激，收获，然后种于包被孔中（间接）。
方法根据：1）被分析的细胞类型；2）预期的细胞密度。如果细胞因子产生细胞的数量很少，建议用直接法实验，但是如果细胞因子产生细胞的数量很多，最好用间接的方法。无论采用直接或间接的方法，所有刺激以后的步骤是相同的。
主要步骤：
1）96孔PVDF板首先以70%乙醇处理，然后以捕获抗体包被。
2）将细胞放入抗体包被过的含有抗原/丝裂原的微孔中，在间接法中细胞被预刺激。
3）细胞用倒置平板法去除，与生物素标记的抗体共育。
4）与结合于碱性磷酸盐的链霉亲和素反应。
5）BCIP/NTB斑点形成。
◆刺激步骤：
小鼠脾细胞在PMA和lonomycin刺激下产生IFN-γ。人的IFN-γ由PBMC在PMA和lonomycin的刺激下产生。
建议步骤：
小鼠1）分离脾细胞，ficoll。间期收获细胞。用PBS洗三次，去除ficoll。2）用培养基稀释细胞（RPMI1640含2mML_glutamine,10%灭活的胎牛血清）含1ng/mlPMA和500ng/mlionomycin(Sigma),加2×10（4）—5×10（4）细胞到抗体包被的PVDF包被板，在孵箱中培养10—15小时。对于其它刺激物孵育时间可能不同，根据细胞因子产生细胞的密度，优化条件。
人用培养基稀释细胞（RPMI1640含2mML_glutamine,10%灭活的胎牛血清）含1ng/mlPMA和500ng/mlionomycin(Sigma),加2×10（4）—5×10（4）细胞到抗体包被的PVDF包被板，在孵箱中培养10—15小时。对于其它刺激物孵育时间可能不同，根据细胞因子产生细胞的密度，优化条件。
●试剂准备
●检测抗体用0.55ml蒸馏水溶解冻干抗体，轻轻混匀溶液并等到所有冻干抗体溶解。
●抗生物素蛋白链霉素-碱性磷酸酶用含1%BSA的PBS稀释（1/1000）
●碱性磷酸盐缓冲液（10×浓缩液）
1L溶液：80gNaCL；2gKH2PO4;14.4gNa2HPO42H2O;2gKCL，加蒸馏水至1升。检查PH在7.2-7.4之间，此溶液在用之前稀释为1×溶液。
●含2%脱脂干奶粉的PBS一块板溶0.2g干粉于10ml1×PBS。
●含1%BSA的PBS一块板溶0.2g干粉于20ml1×PBS。
●含0.1%Tween的PBS一块板溶100μlTween20于100ml1×PBS。
●70%乙醇一块板以3ml蒸馏水和7ml乙醇混匀。
★试剂保存
1）如果短时间内不用，溶解的检测抗体应分装和保存于—20℃，在这种条件下，试剂可稳定保存至少一年。
2）底物缓冲液保存于4℃。
3）链霉亲和素-碱性磷酸酶保存于4℃。
Eli-spot步骤
1PVDF包被板用100ul70%乙醇室温下处理10分钟。
2倒空孔并以100ulPBS洗3次。
3将100ul捕获抗体加到10mlPBS中，混合并分至每孔中100ul，盖上板盖，放至4℃过夜。
4倒空每孔，用100ulPBS洗一次。
5每孔加100ul含2%脱脂干牛奶的PBS，盖板，室温2小时。
6在洗涤槽上轻弹板子倒空液体，并在吸水纸上吸干。
7用PBS洗一次。
8分配每孔100ul细胞悬液（含合适的细胞数和合适的刺激物浓度），细胞可以在体外预刺激（间接Eli-spot）。盖上板，放细胞于37℃CO2孵箱，合适的时间15-20小时。（在此期间不要摇动或平移平板。）
9在洗涤槽上轻弹板子倒空液体，并在吸水纸上吸干。
10每孔加100ul含0.1%Tween20的PBS，4℃放置10分钟。
11用含0.1%Tween20的PBS洗板三次。
12每一块板，稀释100ul检测抗体到10ml含1%BSA的PBS中，每孔加100ul，封闭扳子放于37℃1小时30分钟。
13倒空扳子并用含0.1%Tween20的PBS洗三次。
14每一块板，稀释10ul链霉亲和素-碱性磷酸酶复合物到10ml含1%BSA的PBS中，每孔加100ul，封闭扳子放于37℃1小时。
15倒空，用含0.1%Tween20的PBS洗三遍，反复用吸水纸吸以去尽所有残存的液体。
16每孔加100ul备用BCIP/NBT溶液。
17让反应在室温进行5-20分钟。肉眼可见小斑点形成。
18用蒸馏水洗三次。
19干燥每孔。计数斑点。注意斑点在4℃过夜后可能会变得明显，放置扳子于室温，避免直接光照。
生物素亲和素系统要注意什么问题– 960问答123
列漥疛咱竂鶇2018-02-11
灵敏度
生物素容易与蛋白质和核酸类等生物大分子结合，形成的生物素衍生物，不仅保持了大分子物质的原有生物活性，而且比恬度高，具多价性。此外，每个亲和素分子有四个生物素结合部位，可同时以多价形式结合生物素化的大分子衍生物和标记物。因此，BAS具有多级放大作用，使其在应用时可极大地提高检测方法的灵敏度。
特异性
亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度专一性。因此，BAS的多层次放大作用在提高灵敏度的同时，并不增加非特异性干扰。而且，BAS结合特性不会因反应试剂的高度稀释而受影响，使其在实际应用中可最大限度地降低反应试剂的非特异作用。
稳定性
亲和素结合生物素的亲和常数可为抗原-抗体反应的百万倍，二者结合形成复合物的解离常数很小，呈不可逆反应性；而且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶以及有机溶剂均不影响其结合。因此，BAS在实际应用中，产物的稳定性高，从而可降低操作误差，提高测定的精确度。
普适性
生物素-结合素系统的多功能性还能提供一套统一的研究方法。例如对于某待测分子，已经得到了对于该分子的生物素标记抗原，那么配合结合亲和素的胶体金可以在电镜下观测，配合结合荧光标记的亲和素可以使用流式细胞仪筛选，配合连接到酶的亲和素可以进行ELISA等免疫组化实验。
生物素容易与蛋白质和核酸类等生物大分子结合，形成的生物素衍生物，不仅保持了大分子物质的原有生物活性，而且比恬度高，具多价性。此外，每个亲和素分子有四个生物素结合部位，可同时以多价形式结合生物素化的大分子衍生物和标记物。因此，BAS具有多级放大作用，使其在应用时可极大地提高检测方法的灵敏度。
特异性
亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度专一性。因此，BAS的多层次放大作用在提高灵敏度的同时，并不增加非特异性干扰。而且，BAS结合特性不会因反应试剂的高度稀释而受影响，使其在实际应用中可最大限度地降低反应试剂的非特异作用。
稳定性
亲和素结合生物素的亲和常数可为抗原-抗体反应的百万倍，二者结合形成复合物的解离常数很小，呈不可逆反应性；而且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶以及有机溶剂均不影响其结合。因此，BAS在实际应用中，产物的稳定性高，从而可降低操作误差，提高测定的精确度。
普适性
生物素-结合素系统的多功能性还能提供一套统一的研究方法。例如对于某待测分子，已经得到了对于该分子的生物素标记抗原，那么配合结合亲和素的胶体金可以在电镜下观测，配合结合荧光标记的亲和素可以使用流式细胞仪筛选，配合连接到酶的亲和素可以进行ELISA等免疫组化实验。
链霉亲和素包被到板上能有多少123
齐齐VPhw42018-02-02
总结下各种孔板细胞接种量 仅供参考
细胞培养瓶（板）生长面积容量与细胞数（大约）
96孔板 4~5X10 4 35mm培养皿 1X10 6
48 孔板 1.3X10 5 60mm培养皿 2.6X10 6
24孔板 2.5X10 5 100mm培养皿 7X10 6
12孔板 5X10 5 150mm培养皿 1.8X10 7
6孔板 1.2X10 6
细胞瓶面积 容量 工作体积 细胞数目
612.5cm2 25ml 2ml 5X10 5
25cm2 50ml 5ml 1X10 68
35cm2 75ml 10ml 2X10 6
75 cm2 250ml 15ml X10 6
150cm2 700ml 40ml 1.1X10 7
补充：不同孔板所加培养液的液面都不宜太深，一般在2~3mm范围，结合不同孔的底面积就可算出各培养孔的适宜加液量（参考下表）。若加液量过多会影响气体（氧气）交换，而且在搬动过程中易溢出造成污染。具体所加细胞密度依实验的目的不同灵活掌握。
细胞培养瓶（板）生长面积容量与细胞数（大约）
96孔板 4~5X10 4 35mm培养皿 1X10 6
48 孔板 1.3X10 5 60mm培养皿 2.6X10 6
24孔板 2.5X10 5 100mm培养皿 7X10 6
12孔板 5X10 5 150mm培养皿 1.8X10 7
6孔板 1.2X10 6
细胞瓶面积 容量 工作体积 细胞数目
612.5cm2 25ml 2ml 5X10 5
25cm2 50ml 5ml 1X10 68
35cm2 75ml 10ml 2X10 6
75 cm2 250ml 15ml X10 6
150cm2 700ml 40ml 1.1X10 7
补充：不同孔板所加培养液的液面都不宜太深，一般在2~3mm范围，结合不同孔的底面积就可算出各培养孔的适宜加液量（参考下表）。若加液量过多会影响气体（氧气）交换，而且在搬动过程中易溢出造成污染。具体所加细胞密度依实验的目的不同灵活掌握。
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