用于清醒、自由活动的大鼠微透析的转笼
微量法 100管/96样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义：
POD（EC1.11.1.7）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。
测定原理：
POD催化 H2O2 氧化特定底物，在 470nm有特征光吸收。
需自备的仪器和用品：
试剂的组成：
提取液：液体 100mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：液体 20mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：液体×1瓶，4℃保存；用时加入 3mL试剂一充分溶解待用；用不完的试剂 4℃保存；试剂三：液体 3mL×1瓶，4℃保存。
粗酶液提取：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1的比例（建议 500万细菌或细胞加入 1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30次）； 8000g4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10的比例（建议称取约 0.1g组织，加入 1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。
测定步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 470nm，蒸馏水调零。
2、测定前将试剂一、二和三在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）放置 10min 以上。
3、样本测定表
试剂名称（µL） | 测定孔 |
样本 | 10 |
蒸馏水 | 60 |
试剂一 | 120 |
试剂二 | 30 |
试剂三 | 30 |
在微量石英比色皿或 96孔板中按顺序加入上述试剂，立即混匀并计时，记录 470nm下 30s时的吸光值 A1和 1min30s后的吸光值 A2。计算 ΔA＝A2-A1。
注意：
1、若一次性测定样本较多，可将试剂一、二、三和蒸馏水按比例配成混合液，在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）放置 10min以上，测定时加入 10µL样本和 240µL混合液测
定。
2、如果 ΔA小于 0.005，可将反应时间延长到 5min。如果 ΔA大于 0.5，可将样本用提取液稀释后测定，计算公式中乘以相应稀释倍数。
POD活性计算：
用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、血清（浆）POD活性
单位定义：每 mL血清（浆）在每 mL反应体系中每分钟 A470变化 0.01为一个酶活力单位。
计算公式：
POD（U/mL）=ΔA×V反总÷V样÷0.01÷T=2500×ΔA2、组织、细菌或细胞 POD活性
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位定义：每 mg组织蛋白在每 mL反应体系中每分钟 A470变化 0.01为一个酶活力单位。POD（U/mgprot）＝ΔA×V反总÷（V样×Cpr）÷0.01÷T=2500×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
单位定义：每 g组织在每 mL反应体系中每分钟 A470变化 0.01为一个酶活力单位。POD（U/g鲜重）＝ΔA×V反总÷(W×V样÷V样总)÷0.01÷T=2500×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算
单位定义：每 1万个细菌或细胞在每 mL反应体系中每分钟 A470变化 0.01为一个酶活力单位。
POD（U/104 cell）＝ΔA×V反总÷(500×V样÷V样总)÷0.01÷T=5×ΔA
V反总：反应体系总体积，0.25mL； V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量；500：细菌或细胞总数，500万。
用 96孔板测定的计算公式如下
1、血清（浆）POD活性
单位定义：每 mL血清（浆）在每 mL反应体系中每分钟 A470变化 0.005为一个酶活力单位。
POD（U/mL）=ΔA×V反总÷V样÷0.005÷T=5000×ΔA2、组织、细菌或细胞 POD活性
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位定义：每 mg组织蛋白在每 mL反应体系中每分钟 A470变化 0.005为一个酶活力单位。POD（U/mgprot）＝ΔA×V反总÷（V样×Cpr）÷0.005÷T=5000×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
单位定义：每 g组织在每 mL反应体系中每分钟 A470变化 0.005为一个酶活力单位。POD（U/g鲜重）＝ΔA×V反总÷(W×V样÷V样总)÷0.005÷T=5000×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算
单位定义：每 1万个细菌或细胞在每 mL反应体系中每分钟 A470变化 0.005为一个酶活力单位。
POD（U/104 cell）＝ΔA×V反总÷(500×V样÷V样总)÷0.005÷T=10×ΔA
V反总：反应体系总体积，0.25mL； V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量；500：细菌或细胞总数，500万。
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发布于 ： 2021-08-05
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