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来自 : mayitao

PCR基因扩增仪|PCR反应条件的选择(影响因素)

温度参数:

1、变性:模板变性完全与否是PCR成功的关键,一般先于94(或95)变性310min,接着94变性3060s

2、退火:退火温度一般低于引物本身变性温度5。引物长度在1525bp可通过公Tm=(G+C)×4+(A+T)×2计算退火温度,一般退火温度在4060之间,时间为3045s。如果(G+C)低于50%,退火温度应低于55。较高的退火温度可提高反应的特异性。

3、延伸:延伸温度应在Taq酶的最适温度范围之内,一般在7075。延伸时间要根据DNA聚合酶的延伸速度和目的扩增片段的长度确定,通常对于1kb以内的片段1min是够用的。

循环数:

PCR的循环数主要由模板DNA的量决定,一般2030次循环数较合适,过多的循环数会增加非特异扩增产物,具体要多少循环数可通过预试验确定。

PCR产物积累规律:

反应初期产物以2n呈指数形式增加,至一定的循环数后,引物、模板、DNA聚合酶形成一种平衡,产物进入一个缓慢增长时期(停滞效应),即平台期。到达平台期所需PCR循环数与模板量、PCR扩增效率、聚合酶种类、非特异产物竟争有关。

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