
2x Taq master mix with blue loading dye, 1000 reactions
The Taq Master mix contains recombinant Taq DNA polymerase and loading dye. It is for routine primer extension and efficient for amplification of template up to 5kb.
Content: It contains dNTPs, Taq DNA polymerase, Mg++, 2 x reaction buffer and loading dye. For each reaction, take 12.5ul to mix with your primer, template and make up to 25ul for the final volume with diH2O.
Each reaction contains 1U of Taq DNA polymerase, 1.5mM Mg++ and 400uM dNTPs.
Protocol:
Components / Volume (ul)
Supermix / 12.5 ul
Primers, Template, H20 / 12.5 ul
Template / X ul
Primer 1 / X ul
Primer 2 / X ul
H2O / X ul
Total / 25 ul
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看引物能不能特异性扩增,你可以检查一下扩增后的熔解曲线,一般单一的峰是特异性引物,如果有双峰那就是扩出来了杂带
上面较高的是样本曲线,下面较低的是未加样本(茎环引物和引物、探针都加入)
一般来讲,进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液,只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高,所以每个样品至少要做3个平行孔,以防在后面的数据分析中,由于Ct相差较多或者SD太大,无法进行统计分析。通常来讲,反应体系的引 物终浓度为100-400mM;模板如果是总RNA一般是10ng-500,如果cDNA,通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液,要根据目的基因 的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值,在操作过程中,还需要根据所用MasterMix,模板和引物的不同进行优化,达到一个最佳反应体系。在反应体 系配置过程中,有下面几点需要注意:
1. MasterMix不要反复冻融,如果经常使用,最好溶解后放在4度。
2. 更多的配制Mix进行,减少加样误差。最好能在冰上操作。
3. 每管或每孔都要换新枪头!不要连续用同一个枪头加样!
4. 所有成分加完后,离心去除气泡。
5. 每个样品至少3个平行孔。

