
2x Taq master mix with blue loading dye, 1000 reactions
The Taq Master mix contains recombinant Taq DNA polymerase and loading dye. It is for routine primer extension and efficient for amplification of template up to 5kb.
Content: It contains dNTPs, Taq DNA polymerase, Mg++, 2 x reaction buffer and loading dye. For each reaction, take 12.5ul to mix with your primer, template and make up to 25ul for the final volume with diH2O.
Each reaction contains 1U of Taq DNA polymerase, 1.5mM Mg++ and 400uM dNTPs.
Protocol:
Components / Volume (ul)
Supermix / 12.5 ul
Primers, Template, H20 / 12.5 ul
Template / X ul
Primer 1 / X ul
Primer 2 / X ul
H2O / X ul
Total / 25 ul
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探针的标记方式有放射性标记和非放射性标记。标记物质有放射性元素(如32P等)和非放射性物质(如生物素、地高辛等)。32P是最常用的核苷酸标记同位素,被标记的dNTP本身就带有磷酸基团,便于标记。特点是比活性高,可达9000Ci/mmol;发射的β射线能量高。用它标记的探针自显影时间短,灵敏度高。32P的半寿期短,虽使用不方便,但为废弃物的处理减轻了压力。非放射性标记法有酶标法和化学物标记法。酶标方法与免疫测定ELISA方法相似,只是被标记的核酸代替了被标记的抗体,事实上被标记的抗体也称为探针,现有许多商品是生物素、地高辛标记的。血凝素与生物素有非常高的亲和性,当血凝素标记上过氧化物酶或碱性磷酸酶,经杂交反应最终形成探针-生物素-血凝素酶复合物(ABC法),酶催化底物显色,观察结果。ABC法底物显色生成不溶物,以便观测结果。酶标记法复杂、重复性差,成本高,但便于运输、保存,灵敏度与放射物标记法相当。 ①缺口平移标记法。利用的是DNA聚合酶I能修复DNA链的功能。该法先由DNaseI在DNA双链上随机切出切口,然后DNA聚合酶I沿缺口水解5´端核苷酸,同时在3´端修复加入被标记核苷酸,切口平行推移。缺口平移法快速、简便、成本相对较低、比活性相对较高、标记均匀,多用于大分子DNA标记,(>1000bp最好),但单链DNA、RNA不能用该法标记。
②随机引物法。随机引物是指含有各种可能排列顺序的寡聚核苷酸片断的混合物,因此它可以与任意核苷酸序列杂交,起到聚合酶反应的引物作用。将待标记的DNA探针片断变性后与随机引物一起杂交,然后以此杂交的寡聚核苷酸为引物,在大肠杆菌DNA聚合酶I大断段(KlenowFragment)催化下,合成与探针DNA互补的DNA链,当在反应体系中含有a-32P-dNTP时,即形成放射性同位素标记的DNA探针。具有上述优点,可代替缺口平移法。此外大小、单双DNA均可标记,标记均匀,标记率高,但也不能标记环状DNA。随机引物法标记探针一般长400~600bp。
③末端标记法(又叫尾标)。利用末端转移酶可进行“尾标”,尾标适用于寡核苷酸探针标记,寡核苷酸探针多用于核酸“点”突变的检测,该探针可用核酸合成仪人工合成,克隆出的探针一般较长,特异性好,标记量大,杂交的检出信号强。 1、4—6微米切片,用防脱片胶(多聚赖氨酸)处理过的玻片贴附
2、56—60℃烤片2—16h
3、新鲜二甲苯脱蜡,10minX2(趁热脱蜡)
4、100%乙醇5minX2次,不用浸水,直接空气干燥
5、加入50μl蛋白酶K工作液(蛋白酶K用蒸馏水稀释,浓度为25μg/ml),37℃消化10—15min
6、弃去蛋白酶K工作液,0.1MTBS洗涤3minX3次逐级酒精脱水(85%,95%,100%酒精)1minX3次然后空气干燥
7、加入20μl探针,加盖薄膜。(探针用预杂交液稀释,浓度为5μg/ml)。
8、95℃变性10—12min;立刻置于冰块上,防止复性。
9、37℃杂交16—20h
10、揭去薄膜,每张切片加入以下杂交后洗涤液:
>用2—3滴2XSSC37℃洗涤3minX2次;
>0.5XSSC37℃洗涤3minX2次;
>0.2XSSC37℃洗涤3minX2次;
11、0.1MPBS/TBS缓冲液洗涤,1minX3次
12、滴加小鼠抗地高辛生物素标记的抗体工作液,37℃孵育45—60min;
13、0.1MPBS浸洗,5minX3次
14、滴加高敏碱性磷酸酶链亲和素复合物工作液,37℃孵育45—60min。
15、0.1MPBS浸洗,5minX3次
16、滴加NBT/BCIP显色6—16h,
17、双蒸水终止反应(37℃10min—2h),双蒸水浸洗,5minX2次
18、滴加核固红,30秒—5min;
19、双蒸水浸洗,5minX3次
20、脱水、透明、封片
引物,又名引子。是一小段单链DNA或RNA,作为DNA复制的起始点,在核酸合成反应时,作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链,之所以需要引物是因为在DNA合成中DNA聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有的DNA链上。
上面较高的是样本曲线,下面较低的是未加样本(茎环引物和引物、探针都加入)

