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biopioneerinc/2x Taq master mix with loading dye, 1000 reactions/1/MAT-2.1-10
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biopioneerinc/2x Taq master mix with loading dye, 1000 reactions/1/MAT-2.1-10
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biopioneerinc
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2x Taq master mix with blue loading dye, 1000 reactions


The Taq Master mix contains recombinant Taq DNA polymerase and loading dye. It is for routine primer extension and efficient for amplification of template up to 5kb.

Content: It contains dNTPs, Taq DNA polymerase, Mg++, 2 x reaction buffer and loading dye. For each reaction, take 12.5ul to mix with your primer, template and make up to 25ul for the final volume with diH2O.

Each reaction contains 1U of Taq DNA polymerase, 1.5mM Mg++ and 400uM dNTPs.

Protocol:

Components / Volume (ul)

Supermix / 12.5 ul

Primers, Template, H20 / 12.5 ul

Template / X ul

Primer 1 / X ul

Primer 2 / X ul

H2O / X ul

Total / 25 ul

Biopioneer Brand:

MAT-2.1-10 (MAT-2.1.doc, 35Kb) [Download]

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2021-08-09
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26.基因探针可以是DNA双链、DNA单链或RNA单链,但探针的核苷酸序列是已知的(如测某人是否患镰刀型贫血症),则探针是放射性同位素标记或荧光标记的镰刀型贫血症患者的DNA作为探针。

求各位老师指导一下做荧光定量PCR引物和探针序列怎么设计,做探针的公司哪家性价比比较高,具体是怎么收费的,价格大约多少,谢谢!!!

关键是你稀释后的还是稀释前的,如果没稀释,只要不是在太阳下晒就没事。如果稀释过,建议试用一下。
如果你做的事荧光定量PCR,其引物和一般引物在构成上是没有什么区别的,只是要更加注意引物二聚体、PCR产物大小等问题。染料法不需要其他东西,探针法还需要taqman探针,这个探针的设计是比较有讲究的,并且上面有荧光集团和猝灭基团。具体设计,一般使用相关软件进行。
是RNA探针.TaqMan 荧光探针是一种寡核苷酸探针,荧光基团连接在探针的5’末端,而淬灭剂则在3’末端.PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步.常用的荧光基团是FAM,TET,VIC,HEX. 而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析,又可分析基因突变(SNP),有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台.
探针是能与特异靶分子反应并带有供反应后检测的合适标记物的分子。利用核苷酸碱基顺序互补的原理,用特异的基因探针即识别特异碱基序列的有标记的一段单链DNA(或RNA)分子,与被测定的靶序列互补,以检测被测靶序列的技术叫核酸探针技术。探针制备就是将目的基因进行标记。特异性探针有三种形式——cDNA、RNA、寡核苷酸。cDNA和寡核苷酸是目前最常采用的探针。RNA探针用途很广,也容易获得,但其不稳定性限制了其商业用途。cDNA探针的获得是,将特定的基因片段装载到质粒或噬菌体中,经过扩增、酶切、纯化等复杂的步骤,才能得到一定长度的cDNA探针。这一过程比较复杂,有相应条件的实验室才能做到。寡核苷酸探针是在已知基因序列的情况下,由核酸合成仪来完成,可廉价获得大量的此类探针。质量也相对来说更为稳定。由于cDNA探针长度通常为数百至数千个碱基,所以有良好的信号放大作用,但其渗透性比较差。寡核苷酸探针一般为十数个至数十个碱基,渗透性强,但信号放大作用则较差,合成的多相寡核苷酸探针,敏感性可以达到cDNA探针水平。
探针的标记方式有放射性标记和非放射性标记。标记物质有放射性元素(如32P等)和非放射性物质(如生物素、地高辛等)。32P是最常用的核苷酸标记同位素,被标记的dNTP本身就带有磷酸基团,便于标记。特点是比活性高,可达9000Ci/mmol;发射的β射线能量高。用它标记的探针自显影时间短,灵敏度高。32P的半寿期短,虽使用不方便,但为废弃物的处理减轻了压力。非放射性标记法有酶标法和化学物标记法。酶标方法与免疫测定ELISA方法相似,只是被标记的核酸代替了被标记的抗体,事实上被标记的抗体也称为探针,现有许多商品是生物素、地高辛标记的。血凝素与生物素有非常高的亲和性,当血凝素标记上过氧化物酶或碱性磷酸酶,经杂交反应最终形成探针-生物素-血凝素酶复合物(ABC法),酶催化底物显色,观察结果。ABC法底物显色生成不溶物,以便观测结果。酶标记法复杂、重复性差,成本高,但便于运输、保存,灵敏度与放射物标记法相当。 ①缺口平移标记法。利用的是DNA聚合酶I能修复DNA链的功能。该法先由DNaseI在DNA双链上随机切出切口,然后DNA聚合酶I沿缺口水解5´端核苷酸,同时在3´端修复加入被标记核苷酸,切口平行推移。缺口平移法快速、简便、成本相对较低、比活性相对较高、标记均匀,多用于大分子DNA标记,(>1000bp最好),但单链DNA、RNA不能用该法标记。
②随机引物法。随机引物是指含有各种可能排列顺序的寡聚核苷酸片断的混合物,因此它可以与任意核苷酸序列杂交,起到聚合酶反应的引物作用。将待标记的DNA探针片断变性后与随机引物一起杂交,然后以此杂交的寡聚核苷酸为引物,在大肠杆菌DNA聚合酶I大断段(KlenowFragment)催化下,合成与探针DNA互补的DNA链,当在反应体系中含有a-32P-dNTP时,即形成放射性同位素标记的DNA探针。具有上述优点,可代替缺口平移法。此外大小、单双DNA均可标记,标记均匀,标记率高,但也不能标记环状DNA。随机引物法标记探针一般长400~600bp。
③末端标记法(又叫尾标)。利用末端转移酶可进行“尾标”,尾标适用于寡核苷酸探针标记,寡核苷酸探针多用于核酸“点”突变的检测,该探针可用核酸合成仪人工合成,克隆出的探针一般较长,特异性好,标记量大,杂交的检出信号强。 1、4—6微米切片,用防脱片胶(多聚赖氨酸)处理过的玻片贴附
2、56—60℃烤片2—16h
3、新鲜二甲苯脱蜡,10minX2(趁热脱蜡)
4、100%乙醇5minX2次,不用浸水,直接空气干燥
5、加入50μl蛋白酶K工作液(蛋白酶K用蒸馏水稀释,浓度为25μg/ml),37℃消化10—15min
6、弃去蛋白酶K工作液,0.1MTBS洗涤3minX3次逐级酒精脱水(85%,95%,100%酒精)1minX3次然后空气干燥
7、加入20μl探针,加盖薄膜。(探针用预杂交液稀释,浓度为5μg/ml)。
8、95℃变性10—12min;立刻置于冰块上,防止复性。
9、37℃杂交16—20h
10、揭去薄膜,每张切片加入以下杂交后洗涤液:
>用2—3滴2XSSC37℃洗涤3minX2次;
>0.5XSSC37℃洗涤3minX2次;
>0.2XSSC37℃洗涤3minX2次;
11、0.1MPBS/TBS缓冲液洗涤,1minX3次
12、滴加小鼠抗地高辛生物素标记的抗体工作液,37℃孵育45—60min;
13、0.1MPBS浸洗,5minX3次
14、滴加高敏碱性磷酸酶链亲和素复合物工作液,37℃孵育45—60min。
15、0.1MPBS浸洗,5minX3次
16、滴加NBT/BCIP显色6—16h,
17、双蒸水终止反应(37℃10min—2h),双蒸水浸洗,5minX2次
18、滴加核固红,30秒—5min;
19、双蒸水浸洗,5minX3次
20、脱水、透明、封片
本人做荧光定量PCR,参照基因选择的GAPDH,望好心人能告知GAPDH基因的引物和探针序列,谢谢
prR的引物一般是RNA(单链),而探针是已知碱基序列的dna或rna
核心探针发射器和延伸探针发射器的区别是什么?
基因探针,即核酸探针,是一段带有检测标记,且顺序已知的,与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)。基因探针通过分子杂交与目的基因结合,产生杂交信号,能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。根据杂交原理,作为探针的核酸序列至少必须具备以下两个条件:①应是单链,若为双链,必须先行变性处理。②应带有容易被检测的标记。它可以包括整个基因,也可以仅仅是基因的一部分;可以是DNA本身,也可以是由之转录而来的RNA。

引物,又名引子。是一小段单链DNA或RNA,作为DNA复制的起始点,在核酸合成反应时,作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链,之所以需要引物是因为在DNA合成中DNA聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有的DNA链上。

上面较高的是样本曲线,下面较低的是未加样本(茎环引物和引物、探针都加入)

小妹最近开始做PCR,需要有引物和探针,但是自己不怎么会设计。所以,向各位师兄师姐请教一下,有没有免费设计引物和探针的公司。有的话请告知一下,万分感谢!
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