DIG-DNA标记与检测一、探针DNA标记方法 步骤 ：1．10ng~3ugDNA每管，双蒸水定量至总体积15ul2．沸水水浴10分钟后迅速冰浴3．加入 5号试剂 2ul ， 6号试剂 2ul ，7号试剂 1ul4．37度1小时~20小时5．中止反应 加2ul 0.2M EDTA (pH 8.0) 和/或 65度 水浴 10分钟 二、标记效率检测（一） 试剂配置Solution Composition PreparationWashing buffer 0.1 M Maleic acid, 0.15 M NaCl; pH 7.5 (20° C); 0.3% (v/v) Tween 20Maleic acid buffer 0.1 M Maleic acid, 0.15 M NaCl; adjustwith NaOH (solid) to pH 7.5 (20° C)Detection buffer 0.1 M Tris-HCl, 0.1 M NaCl, pH 9.5 (20° C) TE-buffer 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0 Blocking stock solution Dissolve Blocking reagent (bottle 10) 10% (w/v) in Maleic(10 × conc.) acid buffer underconstantly stirring on a heating block(65°C) or heat in a microwave oven,autoclave. The solution remains opaque Blocking solution Prepare a 1 × working solution by dilutingthe 10 × Blocking solution 1:10in Maleic acid buffer. Antibody solution Centrifuge Anti-Digoxigenin-AP(vial 8) for 5 min at 10 000 rpm in theoriginal vial prior to each use, and pipet the necessary amount carefully from thesurface. Dilute Anti-Digoxigenin-AP 1: 5 000 (150 mU/ml) in Blocking solution. Colorsubstrate Add 40 _l of NBT/BCIP (vial 9) to 2 ml of Detection buffer.solution Note: Store protected from light! （二）对照的标记DNA（4号试剂）系列稀释（三）步骤 1、取以上制备的管2~9各1ul，以及自己标记的探针1ul，点到一小片尼龙膜 2、通过紫外线或者120度半小时使核酸交连到膜上 3、膜置塑料盒中加Maleic acid buffer 20ml ，15~25度轻摇孵育2分钟 4、10ml Blocking solution 孵育30分钟 5、10ml Antibody solution 孵育30分钟 6、10ml Washing buffer 洗2次，每次15分钟 7、10ml Detection buffer中平衡2~5分钟 8、膜在2ml新鲜配制的 Colorsubstrate solution 中避光孵育。显色期间避免摇动 9、中止反应 用TE-buffer或者双蒸水洗5分钟 蛋白酶K预处理三、样品检测与杂交（一） 步骤1、 稀释供试品及阳性对照DNA，点膜2、 通过紫外线或者120度半小时使核酸交连到膜上3、 将标记好的探针稀释到约25ng/ml, 煮沸5分钟后迅速冰浴 4、膜放入预热好的预杂交液（3.5ml/100cm2）中，充分混匀，避免起泡 5、倒掉预杂交液，加入杂交液及已变性的探针。杂交温度下至少孵育6小时 四、洗膜 1、2 × SSC, 0.1% SDS ， 15-25° C，洗膜2次，每次5分钟。 2、0.5× SSC, 0.1% SDS ，预热至65~68° C，洗膜2次，每次5分钟 五、结果检测（一） 试剂配制Solution Composition PreparationWashing buffer 0.1 M Maleic acid, 0.15 M NaCl; pH 7.5 (20° C); 0.3% (v/v) Tween 20Maleic acid buffer 0.1 M Maleic acid, 0.15 M NaCl; adjustwith NaOH (solid) to pH 7.5 (20° C)Detection buffer 0.1 M Tris-HCl, 0.1 M NaCl, pH 9.5 (20° C) TE-buffer 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0Blocking stock solution Dissolve Blocking reagent (bottle 10) 10% (w/v) in Maleic(10 × conc.) acid buffer underconstantly stirring on a heating block(65°C) or heat in a microwave oven,autoclave. The solution remains opaque Blocking solution Prepare a 1 × working solution by dilutingthe 10 × Blocking solution1:10in Maleic acid buffer. Antibody solution Centrifuge Anti-Digoxigenin-AP(vial 8) for 5 min at 10 000 rpm in theoriginal vial prior to each use, and pipet the necessary amount carefully from thesurface. Dilute Anti-Digoxigenin-AP 1: 5 000 (150 mU/ml) in Blocking solution. Colorsubstrate Add 40 _l of NBT/BCIP (vial 9) to 2 ml of Detection buffer.solution Note: Store protected from light! （二） 步骤 1、Washing buffer洗膜1~5分钟 2、100ml Blocking solution 孵育30分钟 3、20ml Antibody solution 孵育30分钟 4、100ml Washing buffer 洗2次，每次15分钟 5、20ml Detection buffer中平衡2~5分钟 6、膜在10ml新鲜配制的 Colorsubstrate solution 中避光孵育。显色期间摇动 7、中止反应 用TE-buffer或者双蒸水50ml洗5分钟展开