The fragmentation of genomic DNA by cellular nucleases during the later stages of apoptosis is also one of the most easily measured features of apoptotic cells. Nuclease activity generates DNA fragments ranging from ~300 bp to 50 bp in length, resulting in a typical DNA "˜laddering"™ appearance when analyzed by agarose gel electrophoresis. These fragments have exposed 3"™-hydroxyl (OH) ends which can be labeled with deoxyuridine triphosphates (dUTP). An enzyme, terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT), is used to catalyze the template-independent addition of fluorescent tagged dUTP to the 3"™-OH ends of double or single stranded DNA. This method is often called TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) or end labeling.
With the APO-DIRECTTM Kit, cells are stained with FITC-labeled dUTP in a single step. Samples can then be analyzed via flow cytometry. Samples that are apoptotic will stain brightly due to the substantial number of exposed 3"™-OH sites, while cells that are non-apoptotic will not have incorporated significant amounts of FITC-dUTP and will stain dimly.
The APO-DIRECT Kit is shipped in one container and consists of two packages. Upon arrival one should be stored at 2-8C and the other at -20C.
Li X, Traganos F, Melamed MR and Darzynkiewicz Z. 1995. Cytometry. 20(2): 172-180.
Tomei LD and Cope FD, eds. 1991. Current Communications in Cell and Molecular Biology. 3: 47-60. Cold Springs Harbor, NY.
Arends MJ, Morris RG and Wyllie AH. 1990. Am J Pathol. 136(3): 593-608.
Darzynkiewicz Z, Crissman HA and Robinson JR, eds. 1994. Methods in Cell Biology: Flow Cytometry Second Edition. 41: 15-38. Academic Press Inc.
Eschenfeldt WH, Puskas RS and Berger SL. 1987. Methods Enzymol. 152: 337-342.
Darzynkiewicz Z, Bruno S, Del Bino G, Gorczyca W, Hotz MA, Lassota P and Traganos F. 1992. Cytometry. 13(8): 795-808.
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TUNEL的缺点是：1），操作要求高，组织样本需要固定（即使是培养细胞，也需要固定），不恰当的固定方法对实验结果影响很大，导致背景过高或者信号过弱，因此实验结果重复性不好;有的人花上半年做一个体内的TUNEL是一点都不奇怪的。2），大部分诱导凋亡的药物也引起DNA损伤，从而产生DNA断裂，易引入假阳性;3）凋亡晚期细胞基因组大量降解，导致TUNEL标记反而减少，因此此法反应的是早期凋亡比例，不能严格反应凋亡比例，属于半定量研究。
尽管有如此多缺点，但由于其是目前为数不多的能原位标记凋亡细胞的方法，因此用于组织体内凋亡研究仍然是首选。但体外细胞实验研究，很少用此法。
凋亡检测中，TUNEL并不是过时的方法，现在研究凋亡的文献仍然常见。而且相反，还比以前多一点，因为现在体内实验越来越多了，甚至线虫的凋亡研究，都用TUNEL。
凋亡研究中，的确有几种方法过时了，当然是因为有替代方案了，比如DNAladder，电镜。至于AnnexinV是不能用来和TUNEL一起评论的，前者用于细胞，而且主要是悬浮细胞，后者主要用于组织。虽然有人也做镜下的AnnexinV观察，TUNEL的细胞staining，但这都不是主流。
回到lz的原帖，的确如大家所言，做贴壁细胞，不推荐用TUNEL。如果是经典凋亡途径，只是确定比例，用最经典，最常用的subG1法即可，如果是不确定是否是凋亡，用AnnexinV，不过贴壁细胞用此法，要注意消化时间。
想请问下那个公司有专门的蛋白质荧光标记试剂盒出售。最好的是CY5的，我准备做三标。性价比越高越好
那些做过的前辈们指导一下。
探针
ddH2O36.25ul
buffer(瓶3)5ul
核苷酸混合液（含DIG-dUTP）(瓶2)2.5ul
dNTPStockSolution(瓶4)2.5ul
引物F1ul(10pmol/ul)
R1ul(10pmol/ul)
酶（瓶1）0.75ul
DNA1ul（100pg）
程序：35个循环，退火温度55度。
第一次通过探针标记得到了相应的PCR标记产物，亮度和对照相当，片段大小比标记的探针模板大，证明整个过程应该没有问题。
但一个月后重新用相同的体系，相同的程序，只是探针模板的量不同却什么都扩不出来。不知道问题出在哪了！
其检测原理为：在正常的活细胞中，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在早期凋亡的细胞中，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。
操作步骤：
1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
在弱碱性（pH 8~9）、暗处、室温或40℃条件下，氨基酸的α-氨基很容易与2,4-二硝基氟苯（缩写为FDNB或DNFB）反应，生成黄色的2,4-二硝基苯氨基酸（dinitrophenyl amino acid，简称DNP-氨基酸）。多肽或蛋白质的N-末端氨基酸的α-氨基也能与FDNB反应，生成一种二硝基苯肽（DNP-肽）。由于硝基苯与氨基结合牢固，不易被水解，因此当DNP-多肽被酸水解时，所有肽键均被水解，只有N-末端氨基酸仍连在DNP上，所以产物为黄色的DNP-氨基酸和其它氨基酸的混合液。混合液中只有DNP-氨基酸溶于乙酸乙酯，所以可以用乙酸乙酯抽提并将抽提液进行色谱分析，再以标准的DNP-氨基酸作为对照鉴定出此氨基酸的种类。因此2,4-二硝基氟苯法可用于鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸。
