
The Guide-it Mutation Detection Kit contains all the reagents needed for PCR-based identification of insertions or deletions generated in the genome of cells treated with engineered nucleases such as zinc-finger nucleases (ZFNs), transcription-activator-like effector nucleases (TALENs), or CRISPR/Cas9. The first step is the amplification of the putative target sequence directly from cells.
The Guide-it Mutation Detection Kit contains all the reagents needed for PCR-based identification of insertions or deletions generated in the genome of cells treated with engineered nucleases such as zinc-finger nucleases (ZFNs), transcription-activator-like effector nucleases (TALENs), or CRISPR/Cas9. The first step is the amplification of the putative target sequence directly from cells. This kit uses Terra PCR Direct Polymerase Mix and Buffer, so there is no need to extract genomic DNA from your cell population prior to amplification of your target sequence. The amplicon is then melted and hybridized to form the mismatched targets for cleavage by the Guide-it Resolvase. Agarose gel electrophoresis can be used to visualize the cleavage products.
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1、 配制JC-1染色工作液:
取适量JC-1 Stain (200×),按照每50μl JC-1 Stain (200×)加入8ml ddH2O的比例稀释JC-1,剧烈Vortex充分溶解并混匀JC-1。然后再加入2ml JC-1 Buffer(5×),混匀后即为JC-1染色工作液。6孔板每孔所需JC-1染色工作液的量为1ml,其它培养器皿的JC-1染色工作液的用量以此类推。
2、 设置阳性对照:
推荐CCCP(10mM)加入到细胞培养液中处理细胞。随后按照下述方法装载JC-1,进行线粒体膜电位的检测。对于特定的细胞,CCCP的作用浓度和作用时间可能有所不同,需自行参考相关文献资料确定。
3、对于悬浮细胞:
a. 取1~6×105细胞,重悬于0.5ml细胞培养液中,细胞培养液中可以含血清和酚红。
b. 加入0.5ml JC-1染色工作液,颠倒数次混匀。细胞培养箱中37℃孵育。
c. 在孵育期间,按照每1ml JC-1 Buffer(5×)加入4ml蒸馏水的比例,配制适量的JC-1 Buffer(1×),并放置于冰浴。
d. 37℃孵育结束后, 4℃ 600g离心3~4min,沉淀细胞。弃上清,注意尽量不要吸除细胞。
f. 再用JC-1 Buffer(1×)重悬后,用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察,也可以用荧光分光光度计检测或流式细胞仪分析。
4、对于贴壁细胞:
注意:对于贴壁细胞,如果希望采用荧光分光光度计或流式细胞仪检测,应先收集细胞,重悬后参考悬浮细胞的检测方法。
a.吸除6孔板培养液,根据具体实验如有必要可以用PBS或其它适当溶液洗涤细胞一次,加入1ml细胞培养液。细胞培养液中可以含有血清和酚红。
b. 加入1ml JC-1染色工作液,充分混匀。细胞培养箱中37℃孵育。
c. 在孵育期间,按照每1ml JC-1 Buffer(5×)加入蒸馏水的比例,配制适量的JC-1 Buffer(1×),并放置于冰浴。
d. 37℃孵育结束后, 吸除上清,用JC-1 Buffer(1×)洗涤2次。
e. 加入2ml细胞培养液,培养液中可以含有血清和酚红。
f. 荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。
5、对于纯化的线粒体:
a. 把配制好的JC-1染色工作液再用JC-1 Buffer(1×)稀释5倍。
b. 0.9ml 5倍稀释的JC-1染色工作液中加入0.1ml总蛋白量为10~100μg纯化的线粒体。
c. 用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测:混匀后直接用荧光分光光度计进行时间扫描,激发波长为485nm,发射波长为590nm。如果使用荧光酶标仪,激发波长不能设置为485nm时,可以在475~520nm范围内设置激发波长。另外,也可以参考下面步骤6中的波长设置进行荧光检测。
d. 用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察:方法同下面的步骤6。
6、荧光观测和结果分析:
检测JC-1单体时可以把激发光设置为490nm,发射光设置为530nm;检测JC-1聚合物时,可以把激发光设置为525nm,发射光设置为590nm。出现红色荧光说明线粒体膜电位比较正常,细胞的状态也比较正常。
注意事项:
1、 JC-1 Stain(200×)应完全溶解混匀后使用,但应避免反复冻融。必须先把JC-1 Stain(200×)用ddH2O充分溶解混匀后,才可加入JC-1 Buffer(1×)。不可先配制JC-1 Buffer(1×)再加入JC-1 Stain(200×),否则导致JC-1很难充分溶解,严重影响后续的检测。
2、 对于6孔板中的样品,本试剂盒共可以检测100个样品;对于12孔中的样品,本试剂盒共可以检测200个样品。
3、 装载完JC-1后用JC-1 Buffer(1×)洗涤时,尽量使JC-1 Buffer(1×)保持4℃左右,此时的洗涤效果较好。
4、 勿把JC-1 Buffer(5×)全部配制成1×,因为操作过程中需直接使用JC-1 Buffer(5×)。
5、 如JC-1 Buffer(5×)中有沉淀,必须全部溶解后才能使用,为促进溶解可以在37℃加热。
6、 CCCP为线粒体电子传递链抑制剂,有一定毒性,请注意小心防护。
试剂盒在全球市场上的研发与销售呈快速上升趋势,2005年全球市场销售额超过200亿美元,且以15%左右的速度逐年增长.一方面是试剂盒的迅猛发展,而另一方面试剂盒市场良莠不齐的现象愈加明显,试剂盒的生产、销售及认证认可体制尚不完善,没有相应的标准或质量评价政策.且其灵敏度,稳定性及假阴/阳性控制尚不能满足检测需要,采用试剂盒进行检测的公信度受到质疑.
同时,食品安全领域是当前问题最多、最受关注的领域,这个领域的检测包括了物理、化学、微生物及分子生物学基础理论,无论是按检测原理、用途还是其它分类方式,涉及食品安全检测项目的试剂盒的品种是最全最多的.因此,从该领域着手从事评价制度的研究,便于获得基础性数据结果,并由此推广至动植物检疫及其它领域.
随着H7N9禽流感疫情的不断发散,国家流感中心已经多次发放人感染H7N9禽流感检测试剂,覆盖了全国31个流感网络实验室,并表示,诊断试剂的广泛发放是实现关口前移,控制疫情传播、蔓延的重要手段.而一旦H7N9监测关口继续前移,主动监测范围扩大,病毒检测试剂的需求量将进一步加大.
可采用H7N9亚型禽流感病毒RNA检测试剂盒(荧光PCR法)和H7N9禽流感病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法),定价分别为48人份/盒和48反应/盒,相比市场此前预期的100-200元之间的价格定位低了很多.在检验方法上,卫纪委提醒,前者需要配备全自动荧光PCR检测仪专用PCR扩增管和核酸分离试剂盒(硅胶膜吸附法)等必须设备及咽拭子样本,后者卫计委推荐采用达安基因生产的核酸提取试剂盒进行检验.
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牛胰岛素,是一种多肽
在1965年9月17日我国完成了结晶牛胰岛素的全合成。经过严格鉴定,它的结构、生物活力、物理化学性质、结晶形状都和天然的牛胰岛素完全一样。这是世界上第一个人工合成的蛋白质,为人类认识生命、揭开生命奥秘迈出了可喜的一大步。这项成果获1982年中国自然科学一等奖。
1953年,英国人F. SangerSanger由于测定了牛胰岛素的一级结构而获得1958年诺贝尔化学奖。

