| Overview |  PrinterFriendlyVersion |
| Ex/Em(nm) | 530/590 |
| MW | N/A |
| CAS# | N/A |
| Solvent | N/A |
| Storage | F/D/L |
| Category | GPCR CalciumGPCRAssays |
| Related | CalciumChannels pHandIonIndicators BiochemicalAssays |
| Spectrum | AdvancedSpectrumViewer |
Warning:Donotaddadditionalprobenecid.
1.PrepareCells:
1.1 Foradherentcells:Platecellsovernightingrowthmediumat40,000to80,000cells/well/100µLfora96-wellplateor10,000to20,000cells/well/25µLfora384-wellplate.
1.2 Fornon-adherentcells:CentrifugethecellsfromtheculturemediumandthensUSPendthecellpelletinRhod-4NWdye-loADIngsolution(seeStep2.4)at125,000to250,000cells/well/100µLfora96-wellpoly-Dlysineplateor30,000to60,000cells/well/25µLfora384-wellpoly-Dlysineplate.Centrifugetheplateat800rpmfor2minuteswithbrakeoffpriortotheexperiments
Note:Eachcelllineshouldbeevaluatedonanindividualbasistodeterminetheoptimalcelldensityfortheintracellularcalciummobilization.
2.PrepareRhod-4NWdye-loadingsolution:
2.1 Thawallthekitcomponentsatroomtemperaturebeforeuse.
2.2 MakeRhod-4NWstocksolution:Add200µLofDMSOintothevialofRhod-4NW(ComponentA),andmixthemwell.
Note:20µLofRhod-4NWstocksolutionisenoughforoneplate.UnusedRhod-4NWstocksolutioncanbealiquotedandstoredat<-20oCformorethanonemonthifthetubesaresealedtightly.Protectfromlightandavoidrepeatedfreeze-thawcycles.
2.3 Make1Xassaybuffer:
a).ForCat.#36334(10plateskit),make1Xassaybufferbyadding9mLofHHBS(ComponentC)intothebottleof10XPluronic®F127Plus(1mL,ComponentB),andmixthemwell.
b).ForCat.#36335(100plateskit),make1Xassaybufferbyaddingthewholebottleof10XPluronic®F127Plus(10mL,ComponentB)into90mLofHHBSbuffer(notincludedinthekit),andmixthemwell.
Note:10mLof1Xassaybufferisenoughforoneplate.Aliquotandstoreun-used1Xassaybufferat<‑20 oC.Protectfromlightandavoidrepeatedfreeze-thawcycles.
2.4 MakeRhod-4NWdyeloadingsolutionforonecellplate:Add20µLofRhod-4NWstocksolution(fromStep2.2)into10mLof1Xassaybuffer(fromStep2.3),andmixthemwell.Thisworkingsolutionisstableforatleast2hoursatroomtemperature.
3.Runcalciumassay:
3.1 Add100µL/well(96-wellplate)or25µL/well(384-wellplate)ofRhod-4NWdye-loadingsolution(fromStep2.4)intothecellplate.
Note:Alternatively,growthecellsingrowthmediumwith5to10%FBStoimprovecellgrowth.Inthiscase,itisimportanttoreplacethegrowthmediumwithHHBSbufferinordertominimizebackgroundfluorescence,andcompoundinterferencewithserum.[Weoffer2separatenowashcalciumassaykits(Cat.#36331and36332)forpeoplewhoprefertokeepthemediumremovalstep].
3.2 Incubatethedye-loadingplateinacellincubatorfor30minutes,andthenincubatetheplateatroomtemperatureforanother30minutes.
Note1:Iftheassayrequires37oC,performtheexperimentimmediatelywithoutfurtherroomtemperatureincubation.
Note2:Ifthecellscanfunctionwellatroomtemperatureforlongertime,incubatethecellplateatroomtemperaturefor1-2hours.
3.3 PreparethecompoundplatewithHHBSoryourdesiredbuffer.
3.4 RunthecalciumfluxassaybymonitoringthefluorescenceintensityatEx/Em=540/590nm.
| References&Citations |  PrinterFriendlyVersion |
1. TerritoPR,HeilJ,BoseS,EvansFJ,BalabanRS.(2007)Fluorescenceabsorbanceinner-filterdecomposition:theroleofemissionshapeonestimatesoffreeCa(2+)usingRhod-2.ApplSpectrosc,61,138.
2. BednarB,CunninghamME,KissL,ChengG,McCauleyJA,LivertonNJ,KoblanKS.(2004)KineticcharacterizationofnovelNR2BantagoNISTsusingfluorescencedetectionofcalciumflux.JNeurosciMethods,137,247.
3. MartinVV,BeierleinM,MorganJL,RotheA,GeeKR.(2004)Novelfluo-4analogsforfluorescentcalciummeasurements.CellCalcium,36,509.
4. StammC,delNidoPJ.(2004)ProteinkinaseCandmyocardialcalciumhandlingduringischemiaandreperfusion:lessonslearnedusingRhod-2spectrofluorometry.ThoracCardiovascSurg,52,127.
5. StammC,FriehsI,ChoiYH,ZurakowskiD,McGowanFX,delNidoPJ.(2003)Cytosoliccalciumintheischemicrabbitheart:assessmentbypH-andtemperature-adjustedrhod-2spectrofluorometry.CardiovascRes,59,695.
6. DuC,MacGowanGA,FarkasDL,KoretskyAP.(2001)CalibrationofthecalciumdissociationconstantofRhod(2)intheperfusedmouseheartusingmanganesequenching.CellCalcium,29,217.
7. DuC,MacGowanGA,FarkasDL,KoretskyAP.(2001)Calciummeasurementsinperfusedmouseheart:quantitatingfluorescenceandabsorbanceofRhod-2byapplicationofphotonmigrationtheory.BiophysJ,80,549.
8. LannergrenJ,WesterbladH,BrutonJD.(2001)ChangesinmitochondrialCa2+detectedwithRhod-2insinglefrogandmouseskeletalmusclefibresduringandafterrepeatedtetaniccontractions.JMuscleResCellMotil,22,265.
9. MacGowanGA,DuC,GlontyV,SuhanJP,KoretskyAP,FarkasDL.(2001)Rhod-2basedmeasurementsofintracellularcalciumintheperfusedmouseheart:cellularandsubcellularlocalizationandresponsetopositiveinotropy.JBiomedOpt,6,23.
10. MurielMP,LambengN,DariosF,MichelPP,HirschEC,AgidY,RubergM.(2000)Mitochondrialfreecalciumlevels(Rhod-2fluorescence)andultrastructuralalterationsinneuronallydifferentiatedPC12cellsduringceramide-dependentcelldeath.JCompNeurol,426,297.
AAT Bioquest AAT Bioquest是一家位于美国的生物公司，前身为ABD Bioquest，总部位于加利福尼亚州。专门从事光学检测技术十多年，一直致力于光谱学检测领域技术的创新和突破。其独特的光学检测技术，综合了化学、生物学和信息学等各个领域的研究，引领了比色、荧光和发光技术新一代光学探针的浪潮。AAT Bioquest在全球拥有强大的经验丰富的专业分销商网络，为从小型研究机构到《财富》500强企业的各类客户提供卓越的产品和定制服务。
美国AATBioquestInc.(前身是ABDBioquest，Inc.)是一家为从事生命科学研究、诊断研发及药物开发的科学家研发、生产和销售生物分析研究试剂和试剂盒的公司。公司致力于光谱学检测领域，包括吸收（颜色），荧光和发光技术。AATBioquest的产品帮助全世界的科学家和生物医药研究者更好的了解生物化学，免疫学，细胞生物学和分子生物学等领域。AATBioquest会不断介绍新产品，快速的丰富各个领域的产品。
1）我们提供反应荧光探针和发光探针，生物素和端粒酶能够应用于标记药物小分子和生物聚合物，如蛋白、核酸以及其他碳水化合物；2）我们研究并生产荧光和发光探针用于检测蛋白，核酸和活细胞。3）我们不断的推出新型的荧光和发光探针用于检测多种酶，特别是检测水解酶和氧化还原酶类；4）我们致力于开发用于信号转导研究的试剂；5）我们提供生理和神经探针，特别是钙离子指示剂和膜电位探针。
作为AATBioquestInc.的中国区域代理，艾美捷科技为中国客户提供光谱学检测领域，包括吸收（颜色），荧光和发光技术等全系列解决方案。我们也将一如既往更加努力为国内用户提供快捷、方便的高质量产品，同时更为您售前售后全面技术支持。
AATBioquest,Inc.(formerlyABDBioquest,Inc.)develops,manufacturesandmarketsbioanalyticalresearchreagentsandkitstoscientistsengagedinlifesciencesresearch,diagnosticR&Danddrugdiscovery.Wespecializeintheareaofphotometricdetectionsincludingabsorption(color),fluorescenceandluminescencetechnologies.TheCompany"sproductsenablescientistsandbiomedicalresearcherstobetterunderstandbiochemistry,immunology,cellBIOLOGyandmolecularbiology.AATBioquestconstantlyintroducesnewproducts,andoffersarapidlyexpandinglistofproductsthataregroupedintoseveralproductlines.
1)Ourreactivefluorescentandluminescentprobes,biotinsandtagenzymesareusedforlabelingsmalldrugmoleculesandbiopolymers,e.g,proteins,nucleicacidsandcarbohydrates;2)Wedevelopfluorescentandluminescentprobesfordetectingproteins,nucleicacidsandlivecells;3)Weconstantlyintroducenovelfluorescentandluminescentprobesfordetectingvariousenzymes,inparticular,hydrolyticandredoxenzymes;4)Wefocusondevelopingreagentsforsignaltransductionresearch;and5)Wealsoofferphysiologicalandneurologicalprobes,e.g.,calciumindicatorsandmembranepotentialprobes.
Besidesthestandardcatalogproductswealsooffercustomservicetomeetyourspecialresearchneeds.Ourcurrentservicesincludecustomsynthesisofcolorimetric,fluorescentandluminescentprobes,customdevelopmentofbiochemical,cell-basedanddiagnosticassaysandcustomscreeningofyourcompoundlibrariesagainstyourdefinedtargetsusingourvalidatedHTSassays.
ebiomall.com
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
1、 配制JC-1染色工作液：
取适量JC-1 Stain (200×)，按照每50μl JC-1 Stain (200×)加入8ml ddH2O的比例稀释JC-1，剧烈Vortex充分溶解并混匀JC-1。然后再加入2ml JC-1 Buffer(5×)，混匀后即为JC-1染色工作液。6孔板每孔所需JC-1染色工作液的量为1ml，其它培养器皿的JC-1染色工作液的用量以此类推。
2、 设置阳性对照：
推荐CCCP(10mM)加入到细胞培养液中处理细胞。随后按照下述方法装载JC-1，进行线粒体膜电位的检测。对于特定的细胞，CCCP的作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行参考相关文献资料确定。
3、对于悬浮细胞：
a. 取1～6×105细胞，重悬于0.5ml细胞培养液中，细胞培养液中可以含血清和酚红。
b. 加入0.5ml JC-1染色工作液，颠倒数次混匀。细胞培养箱中37℃孵育。
c. 在孵育期间，按照每1ml JC-1 Buffer(5×)加入4ml蒸馏水的比例，配制适量的JC-1 Buffer(1×)，并放置于冰浴。
d. 37℃孵育结束后， 4℃ 600g离心3～4min，沉淀细胞。弃上清，注意尽量不要吸除细胞。
f. 再用JC-1 Buffer(1×)重悬后，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，也可以用荧光分光光度计检测或流式细胞仪分析。
4、对于贴壁细胞：
注意：对于贴壁细胞，如果希望采用荧光分光光度计或流式细胞仪检测，应先收集细胞，重悬后参考悬浮细胞的检测方法。
a.吸除6孔板培养液，根据具体实验如有必要可以用PBS或其它适当溶液洗涤细胞一次，加入1ml细胞培养液。细胞培养液中可以含有血清和酚红。
b. 加入1ml JC-1染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中37℃孵育。
c. 在孵育期间，按照每1ml JC-1 Buffer(5×)加入蒸馏水的比例，配制适量的JC-1 Buffer(1×)，并放置于冰浴。
d. 37℃孵育结束后， 吸除上清，用JC-1 Buffer(1×)洗涤2次。
e. 加入2ml细胞培养液，培养液中可以含有血清和酚红。
f. 荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。
5、对于纯化的线粒体：
a. 把配制好的JC-1染色工作液再用JC-1 Buffer(1×)稀释5倍。
b. 0.9ml 5倍稀释的JC-1染色工作液中加入0.1ml总蛋白量为10～100μg纯化的线粒体。
c. 用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测：混匀后直接用荧光分光光度计进行时间扫描，激发波长为485nm，发射波长为590nm。如果使用荧光酶标仪，激发波长不能设置为485nm时，可以在475～520nm范围内设置激发波长。另外，也可以参考下面步骤6中的波长设置进行荧光检测。
d. 用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察：方法同下面的步骤6。
6、荧光观测和结果分析：
检测JC-1单体时可以把激发光设置为490nm，发射光设置为530nm；检测JC-1聚合物时，可以把激发光设置为525nm，发射光设置为590nm。出现红色荧光说明线粒体膜电位比较正常，细胞的状态也比较正常。
注意事项：
1、 JC-1 Stain(200×)应完全溶解混匀后使用，但应避免反复冻融。必须先把JC-1 Stain(200×)用ddH2O充分溶解混匀后，才可加入JC-1 Buffer(1×)。不可先配制JC-1 Buffer(1×)再加入JC-1 Stain(200×)，否则导致JC-1很难充分溶解，严重影响后续的检测。
2、 对于6孔板中的样品，本试剂盒共可以检测100个样品；对于12孔中的样品，本试剂盒共可以检测200个样品。
3、 装载完JC-1后用JC-1 Buffer(1×)洗涤时，尽量使JC-1 Buffer(1×)保持4℃左右，此时的洗涤效果较好。
4、 勿把JC-1 Buffer(5×)全部配制成1×，因为操作过程中需直接使用JC-1 Buffer(5×)。
5、 如JC-1 Buffer(5×)中有沉淀，必须全部溶解后才能使用，为促进溶解可以在37℃加热。
6、 CCCP为线粒体电子传递链抑制剂，有一定毒性，请注意小心防护。
实验室要开展支原体检测，方法是PCR法，先要采购试剂盒，用过的同学给推荐一下好用的品牌呗
公司产品通过ISO9001质量体系认证
公司通过ISO14001环境体系认证
公司产品获得国家多项专利证书
公司产品获得计算机软件著作权
核心科技：自主品牌深芬仪器、中国制造、专利产品、技术保障
运输保证:优质EPE珍珠棉缓冲材料、牛皮瓦楞纸、免熏蒸木箱满足出口及国内运输要求。
售后保证:仪器免费保修一年,终身维护值得信赖！
牛胰岛素,是一种多肽
在1965年9月17日我国完成了结晶牛胰岛素的全合成。经过严格鉴定，它的结构、生物活力、物理化学性质、结晶形状都和天然的牛胰岛素完全一样。这是世界上第一个人工合成的蛋白质，为人类认识生命、揭开生命奥秘迈出了可喜的一大步。这项成果获1982年中国自然科学一等奖。
1953年，英国人F. SangerSanger由于测定了牛胰岛素的一级结构而获得1958年诺贝尔化学奖。
