Description:
ProtoScript® FirstStrandCDNASynthesisKit featurestwooptimizedmixes,M-MuLVEnzymeMixandM-MuLVReactionMix.M-MuLVEnzymeMixcombinesM-MuLVReverseTranscriptaseandMurineRNaseInhibitor,whileM-MuLVReactionMixcontainsdNTPsandanoptimizedbuffer.Thekitalsocontainstwooptimizedprimersforreversetranscriptionandnuclease-freewater.Ananchoredoligo-dTprimer[d(T)23VN]forcestheprimertoannealtothebeginningofthepolyAtail.TheoptimizedRandomPrimerMixprovidesrandomandconsistentprimingsitescoveringtheentireRNAtemplateincludingbothmRNAsandnon-polyadenylatedRNAs.ThefirststrandcDNAproductgeneratedismorethan10kb(Figure1).GeneralInformationforSuccessfulcDNASynthesis:
TemplateRNA
IntactRNAofhighpurityisessentialforsensitiveRT-PCRdetection.RNAshouldhaveaminimumA260/A280ratioof1.7orhigher.
EithertotalRNAormRNAcanbeusedinthereversetranscriptionreaction.TotalRNAisgenerallysufficientformostRT-PCRanalyses.However,ifdesiredmRNAcanbeeasilyobtainedusingaPolyASpinmRNAIsolationKit(NEB#S1560)orMagneticmRNAIsolationKit(NEB#S1550).
TheamountofRNArequiredfordetectiondependsontheabundanceofthetranscriptofinterest.Ingeneral1ngto1μgtotalRNAor0.1-100ngmRNAarerecommended.
FirstStrandcDNASynthesisReaction
DenaturationofRNAandprimerat70°Cfor5minutescanremovesecondarystructuresthatmayimpedelongcDNAsynthesis.However,thisstepcanbeomittedinsomecases(unpublishedresults).
Werecommendincubationat42°Cforonehourformaximumyieldandlength.However,manytargetscanbedetectedafteramuchshorterincubationtime.Forexample,5minutesincubationisenoughfora2kbcDNAsynthesis.
ChoiceofPrimersforReverseTranscription
Oligod(T)primingispreferredformostapplicationsbecauseitensuresthatallcDNAcopiesterminateatthe3´endofthemRNAandproducesthelongestcontiguouscDNA.Ananchoredoligo-d(T)primer[d(T)23VN]forcestheprimertoannealtothestartofthepolyAtail,therebypreventingprimingatinternalsitesinthepolyAtail(1).However,twootherprimingchoicesarepossIBLeifdesired.
TheRandomPrimerMixisanoptimizedmixofhexamerandd(T)23VNprimers.ItprovidesrandomprimingsitescoveringtheentireRNAtemplatesincludingbothmRNAsandnon-polyadenylatedRNAs(suchasribosomalRNAs).TheRandomPrimerMixyieldsshortercDNAsonaverageandcanbeusedforthedetectionofmultipleshortRT-PCRproducts.RandomPrimerMixoffersgoodperformanceinawiderangeofRNAtemplates.
Whenagene-specificprimerisusedinacDNAsynthesisreaction,thecDNAproductcanbeusedonlyforamplificationofthattranscript.ThisprimingmethodgivesgoodresultswhentheamountofRNAislimiting(below10ng)andonlyoneparticularcDNAisdesired.
Recommendedprimerconcentration:
PRIMER--Finalconc.
OLIGOd(T)23VN----5μM
RANDOMPRIMERMIX--6μM
SPECIFICPRIMER --0.1–1μM
FirststrandcDNAsynthesiswascarriedoutwith1XM-MuLVEnzymeMixat42°Cusing2μgofhumanspleentotalRNA.Negativecontrolreactionswerecarriedoutwith1XM-MuLVReactionMix.AfractionofthefirststrandcDNAproductwasusedtoamplifysequencesspecificforthreedifferentmessengerRNAsusing1XLongAmp™Taq2XMasterMix(NEB#M0287).Lane1:1.1kbofbeta-actingene.Lane2:noRTcontrolof1.1kbofbeta-actingene.Lane3:4.7kbofXrn-1gene.Lane4:noRTcontrolof4.7kbofXrn-1gene.Lane5:9.8kbofguaninenucleotideexchangefactorp532.Lane6:noRTcontrolof9.8kbofguaninenucleotideexchangefactorp532.MarkerMis2-LogDNALadder(NEB#N3200).
KitComponents
Thefollowingreagentsaresuppliedwiththisproduct:
| Storeat(°C) | Concentration | |
| Oligod(T)23VN | -20 | 50μM |
| Nuclease-freeWater | -20 | |
| M-MuLVEnzymeMix | -20 | 10X |
| M-MuLVReactionMix | -20 | 2X |
| RandomPrimerMix | -20 | 60μM |
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最近导师要求做一个关于PARP家族蛋白在肝癌和癌旁组织中转录以及表达情况的初步研究，以确定目前的课题是否有很大价值。我之前一直在做湿实验，没有生信背景，所以对这个工作比较头疼。我不会编程（只有很浅薄的R基础），而且没有统计学基础，所以直接上网查找有没有可以在网上直接进行分析的网站。我一开始是上cbioportal上对肝癌的mRNA转录谱进行分析（我只会看网站上红得蓝的表达上调下调的标记，不会看zscore什么的。。。），但网站里面提供的对照是一个所谓的标准正常人。我没查到这个所谓的标准正常人是什么，而且导师说肝癌可能存在个体差异，所以要求用肝癌及其对应的癌旁组织的转录谱和表达谱进行分析。我上GEO搜索癌旁组织（paracanceroustissue），根本什么想要的结果都没有。我现在完全是一头雾水，无从下手，希望有做相关领域工作的前辈们或是做与之类似的工作的前辈们提供指导，非常感谢！
最近导师要求做一个关于PARP家族蛋白在肝癌和癌旁组织中转录以及表达情况的初步研究，以确定目前的课题是否有很大价值。我之前一直在做湿实验，没有生信背景，所以对这个工作比较头疼。我不会编程，所以直接上网查找有没有可以在网上直接进行分析的网站。我一开始是上cbioportal上对肝癌的mRNA转录谱进行分析，但网站里面提供的对照是一个所谓的标准正常人。我没查到这个所谓的标准正常人是什么，而且导师说肝癌可能存在个体差异，所以要求用肝癌及其对应的癌旁组织的转录谱和表达谱进行分析。我上GEO搜索癌旁组织（paracanceroustissue），根本什么想要的结果都没有。我现在完全是一头雾水，无从下手，希望有做相关领域工作的前辈们或是做与之类似的工作的前辈们提供指导，非常感谢！
转录是遗传信息由DNA转换到RNA的过程。作为蛋白质生物合成的第一步，转录是mRNA以及非编码RNA（tRNA、rRNA等）的合成步骤。是遗传信息从DNA流向RNA的过程。即以双链DNA中的确定的一条链（模板链用于转录，编码链不用于转录）为模板，以ATP、CTP、GTP、UTP四种核苷三磷酸为原料，在RNA聚合酶催化下合成RNA的过程。
请教各位，我是做在体实验，在体给予刺激30分钟后观察蛋白的表达变化，结果是蛋白表达升高，但有人质疑30分钟这么短的时间能否真的引起蛋白表达的明显变化，所以请教各位，一般蛋白从转录到表达需要多长时间？
生命活动丰富多彩、千变万化。但是万变不离其宗，不管如何变化都围绕着中心法则展开。核酸作为遗传物质指导蛋白质的表达，表达产生的一些特殊蛋白（如转录因子、调控蛋白）反过来又对DNA指导合成蛋白质的过程进行调控。对基因表达调控的研究一直是生物学研究热点，涉及到生命活动的各个过程，也是各类信号通路研究无法绕过的部分。
当面对某个基因表达调控研究时，第一个想到的研究对象是什么？没错，就是基因的启动子。通过启动子区域对基因表达进行调控是最直接有效的手段，所以也是研究基因表达调控的重点。现在的基因数据库信息丰富，拿到基因及其启动子序列非常简单。那么问题又来了，拿到启动子序列以后，下一步怎么找相关的调控蛋白/转录因子呢？生物信息学方法预测？你会得到很多可能的目标调控蛋白/转录因子，还要做实验一个一个验证。凝胶迁移（EMSA），染色质免疫共沉淀（ChIP）？只能针对已知能与启动子结合的调控蛋白/转录因子，而且还需要相应探针/抗体，对于大量筛选无能为力。
美国Signosis的转录因子(结合启动子)微孔板芯片检测试剂可以方便、高效地解决这一问题。该方法专门用于筛查与特定DNA序列（通常是含有转录因子结合位点的启动子序列）相互作用的调控蛋白/转录因子，获得目的基因的启动子序列后，使用该方法可以筛查48/96种常见的调控蛋白/转录因子与启动子序列结合情况。该方法利用转录因子与特定DNA序列结合的特点，针对每一种转录因子设计相应的生物素标记探针；当混合探针与核蛋白样本共同孵育时，探针与相应的转录因子结合形成转录因子/探针复合物；除去游离的探针，收集转录因子/探针复合物；分离复合物中的DNA探针，探针的量与转录因子含量呈正相关。在探针混合物中同时加入启动子片段，如果DNA序列中含有转录因子结合位点，就会与生物素标记的探针竞争性结合转录因子，转录因子与相应探针形成的复合物减少。通过比较有无目的基因启动子片段中转录因子探针检测差异，可以分析出与无目的基因启动子片段相互作用的转录因子种类。
这种方法可以简单、快速地在48/96种常见转录因子筛选出与目的启动子片段相互作用的调控蛋白/转录因子，从而进一步探索目的基因的表达调控。待筛选的调控蛋白/转录因子都是在生命活动中起重要通的调控蛋白/转录因子，大大方便了后续的基因表调控、信号通路及其它方面的研究。
单等位基因表达（monoallelicgeneexpression）是指在二倍体生物的细胞中一个基因的全部转录本均来自一个等位基因的现象。群体水平的细胞表达谱分析（bulkanalysis）表明，印记效应与等位基因间的相互抑制作用是产生单等位基因表达的两种可能的机制。由于群体水平的分析可能低估了单细胞内单等位基因表达的普遍程度，单细胞水平的研究可以更加全面地揭示细胞内的单等位基因表达现象。
中国科学院遗传与发育生物学研究所多个课题组以水稻叶肉细胞为对象，合作研究并揭示了植物中存在广泛的单等位基因表达。焦雨铃研究组将单细胞转录组的测定技术（single-cellRNA-seq）应用于植物细胞，并成功获得了两个水稻亚种（93-11和Nipponbare）及其正反交后代（F1）的叶肉细胞的单细胞表达谱。钱文峰和王秀杰研究组利用93-11和Nipponbare亚种之间的单核苷酸多态性估计出F1细胞中两个等位基因的表达量。通过比较等位基因的表达量，定义出细胞中单等位基因表达的基因。结果表明，单个细胞中约三分之二的基因是单等位基因表达的。进一步研究发现，等位基因表达的独立性和随机性能够很好地解释细胞中单等位基因表达的现象。该研究在单细胞水平上揭示了单等位基因表达现象的普遍性和可能的机制，为进一步研究细胞内基因表达调控规律奠定了基础。
上述研究成果于2017年9月23日在线发表于ScienceBulletin(DOI:10.1016/j.scib.2017.09.011)。焦雨铃研究组已毕业的博士生韩莹莹和钱文峰研究组的博士生楚霄为该文章的共同第一作者。焦雨铃和钱文峰为该文章的共同通讯作者。王秀杰研究员参与了课题合作。该研究得到了科技部973项目、中组部“万人计划”和植物基因组学国家重点实验室的资助。
图：水稻叶肉细胞呈现出广泛的单等位基因表达
