【求助】Elispot检测单核细胞活化后TNF

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【求助】Elispot检测单核细胞活化后TNF－α释放

2006-01-13

问题描述：

我的实验是检测刺激剂是否能够刺激人单核细胞释放TNF－α。
方法：ELISPOT试剂盒，fromU－CyTechbioscience
刺激剂（实验组）：人巨噬细胞迁移抑制因子（低LPS），1μg/ml
阳性对照：LPS，5μg/ml
阴性对照：无任何刺激剂的单核细胞
单核细胞分选：正常人新鲜全血20ml，经淋巴细胞分离液分离出单个核细胞。磁珠阴性分选单核细胞。
细胞数：3×10^4和1×10^5两种。
结果：在两种细胞数的实验中，阴性对照都有斑点出现，并且和我的实验组还有阳性对照很相似。
实验重复了两次，一直不知道原因何在，严重苦恼中。。。
请战友们提供帮助，指点实验的问题所在。。
先谢了。。。

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MandM

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大家快帮帮我。。。真的好着急。。。：（

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brisk2004

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做ELISPOT实验时，培养基是很重要的一个环节，如果你的培养基中含有热原的话，那么你的ELISPOT中阴性很可能就有一些点出现，还有我不知道你为什么要用磁珠来分离单核细胞？那样有必要吗？在磁珠分离的过程中也有可能受到其他的刺激。还有我不知道你的ELISPOT的基本过程是什么？我把我们的过程大致和你说一下：14度包被抗体过夜2PBS洗板一次，封闭1h,3洗板4次，加入刺激剂，种入细胞，刺激24h小时4PBS3次，PBST3次，加入生物素标记的一抗5PBST6次，加入HRP/AP标记的亲和素6PBST3次，PBS3次，显色

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MandM

用户

谢谢brisk2004先。我的培养基是低热原的，包括血清，也是低热原的进口血清。我第一次做是贴壁分离单核细胞的，结果也是阴性孔有很多点，当时怀疑是不是把单核细胞从平皿上挂下来的时候刺激了它，所以第二次做就用的磁珠阴性分选，这个试剂盒是用磁珠标记除单核以外的单个核细胞的，所以单核细胞理论上应该是不受刺激的。我的具体过程和您的一样。1。70％乙醇活化PVDF膜，无菌水洗。2。4度包被单抗包被过夜3。PBS洗板5次，37度封闭1h。4。PBS洗一次或者不洗。加入50微升刺激剂，接着加入100微升细胞，培养24h。5。倒掉细胞，加入冰冷去离子水，处理10分钟。6。PBST洗10次，加入生物素标记检测抗体，37度1h7。PBST洗5次，加入HRP标记亲和素。37度1h8。PBST洗5次，解冻显色液，每孔100微升，显色5－10分钟。

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