由结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）感染引起的结核病是当前导致发展中国家儿童死亡的重要疾病之一。近年来我国儿童结核病患病人数呈现出明显的快速增长趋势。2000年第四次全国结核病流行病学调查数据显示，14岁以下儿童结核感染率为9%。由于儿童自身免疫力较弱，感染MTB后极易迅速发展为严重的活动性结核病。然而，目前我国儿童结核病的诊治工作却面临着临床快速诊断困难、MTB耐药、非结核分枝杆菌（NTM）感染增多等一系列难题。因此，建立快速准确的新型实验室诊断体系，开展儿童结核病感染菌株病原体鉴定、耐药性监测以及加强结核病患儿的早期诊断势在必行。

近年来，随着分子生物学和免疫学技术的快速发展，以全自动聚合酶链反应（PCR）技术为基础，同时检测MTB和利福平（rifampicin，RIF）耐药的分子生物学检测方法——XpertMTB/RIF试验和以酶联免疫试验为基础，检测MTB特异性的宿主T淋巴细胞的免疫学方法——干扰素-γ释放试验（interferongammareleaseassays，IGRAs），作为结核病快速诊断的新方法应运而生，为儿童结核病诊断提供了新思路。本文将对上述两种实验室诊断新方法及其在临床的应用进行介绍。

一、XpertMTB/RIF试验

1.试验原理：XpertMTB/RIF试验作为一种全自动核酸扩增技术，以半巢式荧光定量PCR技术为基础，以MTB对利福平耐药的相关基因ropB为靶基因，根据其81bp的核心区设计5条相互重叠的探针，同时根据球芽胞杆菌（Bacillusglobigii）基因组设计1条内参探针，使用六重定量PCR对痰液中的MTB进行检测。该方法操作简单，2h内即可读取检测结果。

ropB基因是利福平耐药的相关基因，95%以上的利福平耐药菌株存在ropB基因突变，同时几乎所有利福平敏感菌株在该区域具有相同核酸序列，这一现象也说明ropB基因具有鉴定利福平耐药菌株的能力。此外，由于大部分利福平耐药菌株同时对异烟肼耐药，故利福平耐药情况在一定程度上可以作为耐多药结核病的监测指标。

2.结果判定：MTB检测结果是按照荧光定量PCR中探针Ct值的大小进行判读的。球芽胞杆菌特异性探针的Ct值≤38时，则认为质控指标为阳性；反之，则结果记为无效，代表处理的标本的DNA提取不合格或者含有PCR抑制物。5个探针中至少2个探针的Ct值≤38时，即认为检测到标本中含有MTB。利福平耐药的检测基础在于MTB特异分子信标早期Ct值和晚期Ct值的差异，即ΔCt值。系统设置的结果判断标准是ΔCt＞3.5，代表对利福平耐药，ΔCt≤3.5循环数，代表对利福平敏感。

3.诊断价值：由于结核病患儿体液标本的细菌载量低，病原学培养阳性率及痰涂片阳性率低。因此XpertMTB/RIF试验作为MTB检测的新方法，其临床指导意义尤为重要。由于该试验为2010年世界卫生组织（WHO）推荐使用的结核病诊断新方法，其在儿童结核病领域的研究才刚刚起步。在已发表的文献中，共计有10篇关于XpertMTB/RIF在成人结核病诊断中的独立研究。对患者呼吸道标本的研究发现，XpertMTB/RIF试验在痰涂片阳性结核病中的敏感度为98%~100%，痰涂片阴性结核病中的敏感度为57%~83%。Mooure等对XpertMTB/RIF试验的影响因素进行了分析，结果显示，临床标本MTB含量越高，XpertMTB/RIF试验结果阳性率越高；标本冻存时间长短对XpertMTB/RIF试验结果影响不明显。有研究评估了XpertMTB/RIF在非呼吸道标本中（脑脊液、胃液、组织、胸水、尿液、粪便）诊断结核病的价值。结果显示，以临床综合诊断结果为肺外结核病的诊断金标准时，XpertMTB/RIF试验的敏感度较高，为77.3%~95.0%（另有1篇文献报道的敏感度仅为53%，其样本量较小，仅32份标本）；特异度达到98.2%~100.0%。

在儿童结核病诊断方面，仅南非学者对XpertMTB/RIF试验和传统的痰涂片方法检测MTB的准确性进行了比较研究。该研究纳入了452例15岁以下的疑似结核病患儿，以其诱导痰液的MTB培养结果为金标准，通过对两次诱导痰液标本进行检测，发现XpertMTB/RIF试验的阳性率为75.9%，而痰涂片的阳性率为37.9%；痰涂片阳性者其XpertMTB/RIF结果也均为阳性，痰涂片阴性者中仍有58.1%为XpertMTB/RIF阳性；痰涂片阴性者进行两次重复试验较单次检测的敏感度显著提高（61.0%vs.33.3%）。由此可见，在对疑似结核病患儿进行初筛时，因XpertMTB/RIF试验具有较高的敏感度，可作为痰涂片的替代方法。在临床实际应用中，应至少对标本重复检测两次以提高敏感度。

4.应用前景及局限性：XpertMTB/RIF操作简便快速，可为儿童结核病快速早期诊断提供及时的数据。该试验对呼吸道标本检测的敏感度高，可作为痰涂片检测的有效替代方法；也可用于非呼吸道标本的检测，包括脑脊液、胃液、组织、胸水、尿液、粪便等，因此对肺外结核病的诊断价值较高；同时还能检测利福平耐药情况。然而，由于该方法的硬件要求较高，检测成本高，从而阻碍了其在结核病高发的发展中国家的推广。

总之，XpertMTB/RIF试验以其独特的优点正逐渐成为全球诊断结核病的重要手段。伴随着经济和社会的发展和实验平台的完善，XpertMTB/RIF方法将在更多的领域得到应用。

二、干扰素-γ释放试验

1.试验原理：干扰素-γ主要由MTB抗原活化的效应T淋巴细胞产生，包括CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞。MTB感染者的效应T淋巴细胞，在受到MTB特异抗原早期分泌靶蛋白ESAT-6(early-secretedantigenictarget-6)和培养滤液蛋白CFP-10(culturefiltrateprotein-10)刺激后可分泌干扰素-γ。研究者通过酶联免疫斑点试验（ELISPOT）或者酶联免疫吸附试验（ELISA）的方法对所分泌的干扰素-γ进行定量检测，从而判断机体内是否存在对MTB反应的效应T细胞，对MTB感染进行辅助诊断。

ESAT-6和CFP-10是由MTB基因组RD1区编码的低分子量蛋白。而RD1基因为卡介苗（BCG）菌株在体外传代期间缺失的基因组片断，因此ESAT-6和CFP-10蛋白只存在于MTB复合群中，在卡介苗菌株和大部分环境分枝杆菌中缺乏，理论上能区分卡介苗或MTB自然感染所致的结核菌素（PPD）试验阳性结果。

2.结果判定：目前干扰素-γ释放试验成熟的商品化试剂盒产品主要为T-SPOT-TB（T-SPOT）试剂盒和QuantiFERON-TBGoldIn-Tube（QFT-GIT）试剂盒，两种试剂盒分别根据ELISPOT和ELISA的原理而设计。

T-SPOT-TB试剂盒的结果根据斑点数进行判读，1个斑点代表1个分泌干扰素-γ的效应T细胞。阴性孔和阳性孔为质控作用，如阴性孔斑点数﹥10，说明可能存在细菌污染，如阳性孔斑点数﹤20，说明可能存在细胞数量或活力不足。出现这两种结果可根据具体情况判断。如阴性对照斑点数为0～5个，任何1个检测孔计数减去阴性孔计数≥6判定为阳性；如阴性对照斑点数≥6，检测孔斑点数≥2倍阴性对照孔斑点数，也判定为阳性。

QuantiFERON-TBGoldIn-Tube试剂盒的结果根据各孔干扰素-γ浓度值进行判读。检测孔干扰素-γ浓度减去阴性孔干扰素-γ浓度≥0.35IU/ml，且干扰素-γ浓度≥25%阴性孔判定为阳性。检测孔干扰素-γ浓度减去阴性孔干扰素-γ浓度≥0.35IU/ml，但干扰素-γ浓度＜25%阴性孔或检测孔干扰素-γ浓度减去阴性孔干扰素-γ浓度＜0.35IU/ml判定为阴性。

阳性结果提示测试样本中含有针对MTB特异的效应T淋巴细胞，患者存在结核感染。但是否为活动性结核病，则需要结合临床症状及其他检测指标综合判断。阴性结果提示测试样本中不含有针对MTB特异的效应T淋巴细胞。但如存在以下情况：①少数被检测者存在免疫系统功能不全或免疫系统疾病时，②实验非正常操作引起的差异等，阴性结果并不能排除结核感染的可能。

3.诊断价值：PPD试验作为传统的儿童结核病免疫学检测方法，仍是当前结核病诊断的重要指标之一。然而，该方法却存在着以下几个缺点：①PPD试验所用的抗原为成分不明确的复合抗原，其中大多数为卡介苗菌株和分枝杆菌共同的抗原，可引起机体迟发型变态反应而导致假阳性结果；②在免疫抑制者、新近感染者、营养不良者以及幼儿中，PPD试验会出现假阴性结果，导致其敏感度降低。因此，干扰素-γ释放试验以其较高的敏感度和特异度逐渐得到了广泛应用。

在已发表的文献中，共有16篇关于干扰素-γ释放试验对儿童结核病诊断的独立研究。一项META分析显示，干扰素-γ释放试验在结核病患儿中诊断的敏感度与PPD试验相似，为85%；而在健康儿童中筛查潜伏结核感染者时，由于其不受卡介苗接种的影响，显示出了较高的特异度(90%~100%)，远高于PPD试验（56%）。国外学者Chun等对71例接种过卡介苗的儿童研究发现，其PPD试验的阳性率明显高于干扰素-γ释放试验，提示PPD试验受卡介苗接种的影响，其特异性低；另一项研究显示，由于NTM的影响，PPD试验的特异度只有22%，而干扰素-γ释放试验的特异度高于PPD试验。同样Detjen等也证实了这一结论。

另外，还有研究在结核病接触儿童中以接触者暴露程度的等级作为金标准，对干扰素-γ释放试验的应用价值进行了评价，发现干扰素-γ释放试验阳性率与近期结核病密切接触史的相关性明显高于PPD试验。Ewer等发现干扰素-γ释放试验和PPD试验一致性较好（κ=0.72），而前者与结核感染暴露程度相关性更高。上述结果提示，在有结核病接触史的人群中进行干扰素-γ释放试验筛查结核感染者具有很好的指导价值。

4.应用前景及局限性：干扰素-γ释放试验的优点在于：①不受卡介苗接种的影响，因此被美国疾病预防控制中心（CDC）推荐作为卡介苗接种儿童结核感染检测的首选；②不受NTM和其他细菌感染的影响，可用于结核病的鉴别诊断，如呼吸系统疾病与结核病的鉴别诊断、不明原因发热患儿结核感染排查、克罗恩病和肠结核的鉴别诊断等；③受机体免疫学状态的影响较小，也可以用于艾滋病/结核病（HIV/TB）双重感染人群的检测、免疫抑制剂治疗前后的筛查、大剂量激素治疗前后的筛查等；④其他优于PPD试验的方面，如检测过程短，24h即可得结果；不需要患者重返医院进行结果读取；结果读取避免了一定的主观性等。

干扰素-γ释放试验检测以T细胞介导的免疫应答，在结核感染早期、机体内细菌载量较低时就可灵敏地检测到效应T细胞分泌的干扰素-γ，从而显示阳性结果，但该试验无法区分潜伏结核感染和活动性结核病。另外，由于该试验对操作技术要求较高、成本较高，因此可以作为PPD试验初筛后的补充方法，辅助临床医师排除PPD试验的假阳性结果。

干扰素-γ释放试验以其较高的敏感度和特异度正逐渐成为当前结核病诊断的重要手段，并已被广泛应用于：①儿童结核病的辅助诊断，如痰培养阴性或者涂片阴性结核病患儿的辅助诊断、肺外结核病的鉴别诊断、抗结核病治疗的疗效评估等；②儿童结核感染的筛查，如使用免疫抑制剂治疗、HIV感染、糖尿病、血液病等患儿的筛查；③结核病接触儿童感染风险的评估等。总之，干扰素-γ释放试验将在儿童结核病诊断中发挥越来越重要的作用。