【盐野义制药】
| 实验材料 | 蛋白质样品 试剂、试剂盒 | 裂解液PBSG250考马斯亮蓝溶液NaClSDS上样缓冲液电泳缓冲液转移缓冲液丽春红染液封闭液TBSTTBS洗脱抗体缓冲液显影液定影液抗体化学发光试剂 仪器、耗材 | 高压锅玻璃匀浆器高速离心机分光光度仪-20℃低温冰箱垂直板电泳转移装置恒温水浴摇床多用脱色摇床 实验步骤 | 一、操作步骤： 1.蛋白样品制备 （1）单层贴壁细胞总蛋白的提取： ②每瓶细胞加3ml4℃预冷的PBS（0.01MpH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 ③按1ml裂解液加10μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。） ④每瓶细胞加400μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 ⑤裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） ⑥于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷） ⑦将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于-20℃保存。 （2）组织中总蛋白的提取： ①将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。 ②加400l单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。 ③几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。 ④裂解30min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。 （3）加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取： 由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（1）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取： ①将培养液倒至1.5ml离心管中，于2500rpm离心5min。 ②弃上清，加入4mlPBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。 ③用枪洗干上清后，加100μl 裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。 ④将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。 2. 蛋白含量的测定 （1）制作标准曲线 ①从-20℃取出1mg/mlBSA，室温融化后，备用。 ②取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0 μg，2.5 μg，5.0 μg，10.0 μg，20.0 μg，40.0μg。 ③按下表在各管中加入各种试剂。
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发布于 ： 2021-09-18
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