【求助】反转录酶必须要引物吗
2021-08-18
问题描述：
我提取的RNA反转录，用的是0ligdT为引物，但是我能用反转录为模板扩出18S的rRNA来。我查了下反转录需要引物，我用的引物是0ligdT，本来只能反转录mRNA的啊，拿扩18S rRNA中间片断的引物不应该能从我的反转录产物中扩出18S中间片断来啊？
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dhh
用户
解答资料原理均来自分子生物学教程，个人总结分析，请参考：1．Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。2．Jinhoucong战友所说的“用的是0ligdT为引物，但是我能用反转录为模板扩出18S的rRNA来”.似乎很奇怪，但是分析下就知道原因了：其实不是因为反转录酶的问题，而是由于提取总RNA时手法问题导致有DNA污染.那么18S的rRNA被扩增出来的原因就很简单了。3.虽然不少反转录酶也有聚合酶的作用,但是没有引物,如何聚合呢?4．除非是您做了高质量的mRNA纯化，或者是反转录后采用Rnase消化过，那么应该就不会出现这个问题了。5．建议如果打算使用18S rRNA作为内参，那么最好使用六核苷酸随机引物。这样得到的cDNA里面rRNA将占95%左右。18S rRNA作为内参还是比较稳定的。欢迎继续交流。
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jinhoucong
用户谢谢dhh！反转录的模板应该没有基因组DNA污染了，因为我用了DNase处理。我在想是不是有降解的RNA小片断，作为了随机印物？
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