不同片段的Dig—HBV—DNA探针在检测血清HBV—DNA的比较
| 实验材料 | 限制性内切核酸酶T4噬菌体DNA聚合酶模板DNA 试剂、试剂盒 | 醋酸氨乙醇酚氯仿T4噬菌体DNA聚合酶缓冲液dNTP溶液 仪器、耗材 | SephadexG-50离心柱水浴 实验步骤 | 一、材料 1.缓冲液和溶液 醋酸氨（10mol/L) 乙醇 酚：氯仿（1:1，V/V) 2.酶和缓冲液 适当的限制性内切核酸酶 T4噬菌体DNA聚合酶 10XT4噬菌体DNA聚合酶缓冲液 3.核酸和寡核苷酸 含三种来标记的dNTP溶液，浓度各为2mmol/L 含一种未标记的浓度为2mmol/L的dNTP的溶液 模板DNA(0.1~5μg) 4.放射性复合物 [α-32P]dNTP(10mCi/ml，比活性为800~3000Ci/mmol） 5.专用设备 SephadexG-50离心柱，用TE(pH7.6)平衡 预设定至70℃的水浴 二、方法 1.用产生平端或3突出端的限制酶消化0.1~5.0μg模板DNA。 2.用酚:氯仿抽提及在2.5mol/L乙酸铵的存在下用乙醇沉淀纯化DNA。 3.将DNA沉淀溶于： 10XT4噬菌体DNA聚合酶缓冲液 2μl 2mmol/L三种未标记的dNTP溶液 1μl 10mCi/ml[α-32P]dNTP (800~3000Ci/mmol） 1μl T4噬菌体DNA聚合酶（2.5单位/μl）1μl 水 加至20μl 37℃温育5min。 4.加入1μl2mmol/L未标记的第四种dNTP溶液，继续温育10min。 5.70℃加热5min以终止反应。 6.用SephadexG-50离心柱层析或在2.5mol/L乙酸铵的存在下进行两轮乙醇沉淀分离标记的DNA与未掺入的dNTP。 |
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发布于 ： 2021-08-27
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