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| 实验材料 | 核酸酶 试剂、试剂盒 | ATPCTPGTPMUTPEDTANaCl甲酰胺Tris-HClRNaseARNaseT1RNasinDTTUTPT7RNA聚合酶DNaseⅠ饱和酚氯仿酵母tRNANaAc无水乙醇SDS蛋白酶K异丙醇丙烯酰胺亚甲双丙烯酰胺TBE尿素过硫酸胺TEMED 仪器、耗材 | 低温离心机恒温培养箱恒温水浴锅电泳仪保鲜膜 实验步骤 | 1. 在一个高压过的微量离心管中建立20μl的反应复合物如下： （1）4μl 5×转录缓冲液 （2）1μl 200mmol/的3NTP混合液 （3）10μl ［α-32P］CTP （4）1μl 胎盘核酸酶抑制剂 （5）1μl 1mg/ml模板DNA （6）1μl 噬菌体RNA聚合酶 （7）SP6RNA聚合酶反应时在40℃保温30~60min。采用T7或T3RNA聚合酶则在37℃温育。 2. 加人5μg或10U无RNA酶的酶I，37℃温育15min。 3. 加入2μl10mg/ml的tRNA，补水至50μl，以酚/氯仿/异戊酵抽提。 4. 水相加入200μl，2.5mol/l 乙酸铵和750μl无水乙醇，混匀后在冰浴饭置15min，于4℃在微量离心机中离心15min。 5. 重溶于50μl水，按第4步操作所述重新沉淀两次，最后得到的沉淀以75%乙醇/25%0.1mol/lpH5.2的乙酸钠缓冲液洗涤，晾干沉淀并溶解于100μl杂交液，取1μl计数。 6. RNA以乙醇沉淀，并溶解于30μl含5×105cpmRNA探针的杂交液中，于85℃加热变性5min，移至设定的杂交温度（30~60℃），温育8h以上。 7. 加入350μl含40μg/ml的核酸酶A和2μg/ml核酸酶T1的核酸酶消化缓冲液，于30℃温育30~60min。 8. 加入10μl20%SDS和2.5μl20μg/ml的蛋白酶K，37℃温育30~60min。 9. 用400μl酚/氯仿/异戊醇抽提，水相移入含1μl10mg/mltRNA的离心管中，加入1ml乙醇沉淀，晾干后溶解于3~5μlRNA加样缓冲液中。 10. 于85℃加热变性3min，在变性的聚丙烯酰胺/尿素凝胶（序列胶）中电泳，用增感屏放射自显影过夜，分析结果。 |
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发布于 ： 2018-08-10
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