| 实验步骤 | 用展示TAT转导域的X噬菌体输送DNA到哺乳动物细胞材料试剂 氯化铯 氯仿 DAPI(4，,6-diamidine-2-phenylindoleHCl DNaseI(Sigma-Aldrich) H-SM缓冲液（含lOmmol/LHEPES^NaOH溶液、lOmmol/LMgSO4溶液、lOOmmol/LNaCl溶液，pH7.5) LE392细胞 萤光素酶检测试剂盒（Promega) LysogenicEsc/ieric/iiacoZi，人D1180-GFP，或D1180蛮光素酶 培养基 DMEM培养基，含10%胎牛血清，用于COS^l、293、A431、NIH-3T3细胞培养 MEM培养基，含10%胎牛血清，用于WI38/VA13/2RA、HeLa细胞培养 LB培养基，含10g/L胰蛋白胨（BectonDickinson),5g/L酵母提取液（BectonDickinson)，10g/LNaCl,10mmol/LMgSO4，10ug/ml氨节西林 噬菌体染色体DNA(10ng，纯化，2.5XlO8个拷贝） 质粒：pTRC-D、pTrc-TAT-D、pTrc-RGI>D、pTrc-VN-D、pTrc-NLS——D，从pTDrcHisA构建（Invitrogen) 噬菌体 不同类型的重组噬菌体（2.5X108pfu) TAT噬菌体（2.5X106pfu或2.5X109pfu) 野生型噬菌体（2.5X1010pfu) 仪器 透析袋 荧光显微镜 GFPAcube和WUcube(OlympusOpticalCo.Ltd,Tokyo,Japan) classchamberslide 32°C、37°C、38°C和45°C的培养箱 24孔板 方法 制备重组X噬菌体 1.32°C下，用LB(含10mmol/LMgSO4、100/ng/mL麵节西林）培养质粒转化的溶源性大肠杆菌，直到ODmd的吸光值达到0.3。 2.45°C培养细菌15min,然后38°C培养180min。 3.用氣仿（终浓度10%)和DNaseI(终浓度IOlUgAnl)处理细菌，收获噬菌体颗粒。 4•两轮氯化铯平衡离心分离噬菌体顆粒，然后在H-SM缓冲液中透析纯化。 5.用LE392细胞作为宿主细胞，37°C下用空斑实验（Plaqueassay)测定滴度。 用重组噬菌体诱导标记基因的表达 6•在24孔板中将待转染细胞以每孔2.5X104个细胞的密度接种，培养I2h。 7•用培养基清洗细胞一次，用含2.5XIO8Pfu重组噬菌体或IOng纯化噬菌体染色体DNA的500ul培养基在37°C下培养细胞6h。 8•用培养基清洗细胞两次，继续培养48h。 9•收集细胞，用萤光素酶检测试剂盒定量分析萤光素酶的活性，用带标准差的平均相对荧光单位（RLU)表示结果。 在培养细胞中原位检测TAT-噬菌体介导的GFP的表达 10.以每孔2.5XIO4个的密度在glasschamberslide接种COS^l细胞，培养12h。 11.用培养基清洗细胞一次，然后用含2.5XIO10pfu或2.5X109pfu的TAT噬菌体,或2.5X1010Pfu的野生型噬菌体的500ul养基在37°C下培养细胞6h。 12.用培养基清洗细胞两次，继续培养48h。 13.收集细胞，用DAPI将细胞核染色，用荧光显微镜观察GFP的表达。 |
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