| 实验步骤 | 基因克隆这一方法需要两步PCR(Blommeletal.,2006;Thaoetal.,2004)。图37.2提供了pEU-HSCB的载体图谱和用于克隆His6-细菌视紫红质的引物设计例子(BlommelandFox，2007)。使用这一载体和引物设计方案，TEV蛋白酶能够切MGHHHHHHAIAENLYFQ序列，从而丝氨酸成为成熟蛋白质的第一个氨基酸。烟草花叶病毒omega序列为翻译增强子序列(Sawasakietal.,2000)。将Sg/I和PmeI酶切位点加人相应引物中标明的位置，便可用FlexiVectorcloning方法(Blommeletal.,2006)将克隆的基因转移到表37•1中提到的任一（或所有）载体以及许多其他商品化的载体（见http://www.Promega.comforotherexamples)中。当相应的转化物在含有5%蔗糖的平板上生长时，图37.2中显示的sac&CAT盒能够提供毒性筛选。这种方式能够更有效的筛选包含目的基因的阳性克隆，同时sac&CAT也提供了针对氯霉素的抗性。pFIK同源区增强了在不同Flexi载体间转移克隆基因的效率(Blommeletal.,2006)。 图37.2B给出的例子中，第一步PCR使用的5’正向引物含有基因特异的核苷酸序列，并在5’末段加入了一段能够编码部分TEV酶切位点的不变序列。图37.2C中显示的3’反向互补引物包含了基因特异的核苷酸和PmeI位点。可以通过在设计引物时替换特异基因序列以克隆其他基因。 第二步PCR使用了通用的正向引物（图.37.2B)，其中含有能补全TEV酶切位点的序列和Sg/I位点。通用的反向PCR引物用于复制PmeI位点并加人附加的核苷酸（图37.2B)。在第二步PCR中，将第一步PCR的部分产物加人含有通用正向引物和反向引物的新PCR反应体系中,从而获得可正确用于FlexiVectorcloning的PCR产物。 PCR产物纯化PCR产物在Sg/I/PmeI酶切前需纯化。 材料和试剂 PCR纯化试剂盒[Quickstep2PCRpurificationkit(EdgeBio，Gaithersburg，MD)]，含有SOPE树脂、安全的无菌密封带、performaUltra96孔平板和V-Bottom96孔板。 实验方案 ⑴加4uL充分混悬的SOPE树脂到20jlxLPCR产物(来自上述FLEXI-TEVPCR实验方案)。 (2)用安全的无菌密封带密封板子并涡旋。悬液室温静置。同时准备;performaUltra96孔平板。 (3)去除PerformaUltra96孔平板顶部和底部的黏性密封，加上盖子。 ⑷将PerformaUltra96孔平板叠在一个96孔平底微量培养板之上。 (5)将此装置放人有衬塾的离心用平板托架(platecarrier)。 (6)850g离心5min。 (7)短暂离心使SOPE/PCR混合物富集到孔的底部。缓慢用移液器将SOPE/PCR反应混合物直接转移到PerformsUltra96孔平板。确保液体流进胶基质。加上盖子。 (8)将PerformaUltra96孔平板叠在96孔V-bottom微量培养板之上。 (9)将此装置放人离心机平板托架,850g离心5min。保留内含纯化PCR产物的洗出液。PCR产物在准备使用前可以保存在一20°C。 Flexi载体和PCR产物酶切反应以下步骤是在连接前用Sg/I和PmeI消化pEU载体变体和纯化的PCR产物。使用FIexiVecotr系统克隆的额外描述参见其他文献（BlommelandFox，2007;Blommel 试剂 5XFlexi消化缓冲液(Promega);10XSgf1/PmeI酶混合剂(Promega);pEU载体变体(表37.1);纯化PCR产物[自PCR产物纯化实验方案第(9)步]。 连接反应酶切和纯化后的PCR产物及pEU变体载体在本步骤中连接。为了获得最高效率的连接反应，要点是使用高浓度的连接酶。 试剂 10XT4DNA连接酶缓冲液(Promega);高浓度的T4DNA连接酶(Promega);pEU变体载体（自Flexi载体消化反应第(2)步）； 纯化后的PCR酶切产物[来自PCR产物酶切反应第(6)步]。 实验方案 (1)建立连接MasterMix，包含225ul无菌去离子水、IlOuL10XT4连接酶缓冲液和50ul高浓度的T4DNA连接酶。 (2)向新PCR板的每个孔中加人:5.0ul纯化后的PCR酶切产物、2.0ul消化的pEU载体和3.5pL连接MasterMix。此为连接板(ligationplate)。 (3)将连接板在热循环仪中25°C孵育3h。 (4)立即转化或在4°C过夜保存连接板。 转化反应以下步骤为连接反应产物转化感受态细胞。按照制造商的实验方案，Invitrogen和Promega的感受态细胞均已成功使用。 材料和试剂 用于转化的10G化学感受态细胞（LUCigen,Middleton,WI);10G细胞回收液(Lucigen);连接板[来自连接反应第（4)步];Fisherbnmd无菌一次性培养皿（60mmX15mm)(FisherScientific,Pittsburgh,PA);YT琼脂平板，含有0.5%(W/V)葡萄糖、50ug/mL卡那霉素,并含有5%蔗糖用于筛选pEU-HSCB载体(图37.2);ColiRoiler平板珠（Novagen，Gibbstown，NJ)。 实验方案 (1)将10G化学感受态细胞从一80°C冰箱取出放于冰上融化。 (2)均分10ul细胞到预冷的PCR板或strip管中。 (3)加人I.0连接产物后用移液枪头尖搅勻。 (4)冰上孵育至少5min。将热循环仪设置锁定到34°C。 (5)34°C热休克30s(小的反应体积要按制造商的说明）。 (6)转化反应物放回到冰上，孵育2min。 (8)37°C孵育Ih。不要摇动。 (9)在孵育转化物的同时，标记％个含有合适抗生素和A1-H12的YT板底部,并在每个板中加入5〜10个无菌ColiRoller玻璃珠。 (10)向每个对应标记的板子中加入全部的转化反应物。圆周运动摇动板子使液体分散。翻动板子小心将ColiRoller珠移出到合适的废液容器中，或者放人100%乙醇以备下次使用。 (11)37°C过夜孵育板子。 质粒DNA的纯化所有用于体外转录和翻译的试剂必须是无RNA酶的。因此，所有用于制备无细胞反应的玻璃器皿一定要在18〇°C烘烤3h以去除RNA酶。此外，要戴手套，并在处理试剂时避免说话和打喷嚏以防止手上和唾液中的RNA酶污染。除非另有说明，所有缓冲液必须用〇.2um滤器过滤除菌,保存在一20°C。 另外，除非另有说明，用18MΩ的水(Milli-Qwater,Millipore,Billerica,MA)制备所有试剂。焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水不能用于本实验方案，因为DEPC的降解产物会抑制体外转录和翻译反应。 试剂 用于蛋白酶K的10X缓冲液包含10mmol/LTris-HCl(pH8.0)、50mmol/L 蛋白酶K购自Sigma/Aldrich(St.Louis，MO)。在I.0mLIOX蛋白酶K的缓冲液中加入0.5mg蛋白酶K以制备IOX蛋白酶K溶液。将此蛋白酶K溶液分装为10ul并保存在一80°C。 mRNA制备在无细胞翻译中，mRNA是蛋白质合成反应必要的反应物。为了获得最高的转录效率,必须加人足够量的mRNA以饱和翻译反应中的核糖体。 试剂 含Mg转录缓冲液(5X):400mmol/LHEPE-KOH(pH7.8)、100mmol/L乙酸镁、10mmol/L盐酸精脒（spermidinehydrochloride)和5〇mmol/LDTT。一20°C保存。 NTP溶液：含有25mmol/L的ATP、GTP、CTP和UTP,分别由0.2um滤器无菌过滤的100mmol/LNTP(Milli-Q水溶解)制备。NTP溶液保存在一80°C。 SP6RNA聚合酶和RNA酶抑制剂(RNasin)购自Promega。 脂质体的制备将单室脂质体加入无细胞翻译反应中以捕获新翻译的膜蛋白。这一步骤提供了与用去污剂增溶膜蛋白不同的另外一种方法。去污剂的存在会导致不能直接测定膜蛋白的功能。 材料和试剂 大豆完全抽提物（2〇%卵磷脂)购自AvantiPolarLipids(Alabaster，AL)。 脂质再水化缓冲液（lipidrehydrationbuffer):25mmol/LHEPES(pH7.5)、IOOmmol/LNaCl。 0.4um和0.Ium的径迹蚀刻聚碳酸醋膜(Track-etchpolycarbonatemembrane)，购自Nucleopore(Pleasanton，CA)。 用于制备单室脂质体的迷你型挤压机购自AvantiPolarLipids。 实验方案 (1)将Ig大豆完全抽提物(2〇%卵磷脂)溶解于3mL氯仿。 (2)用N2气流冲洗脂质溶液以去除大部分有机溶剂。真空干燥剩余脂质30min。 ⑶用67mL的脂质再水化缓冲液重悬干的脂质。涡旋脂质溶液直到勻质。3〜5个冻融(freeze/thaw)循环会帮助脂质的水化。 (4)通过迷你型挤压机形成单室脂质体。先将脂质体溶液穿过0.4的Tracketch聚碳酸酯膜11次,再穿过0.Ium的Track-etch聚碳酸酯膜11次。 (5)分装脂质体并快速冷冻。此方法制备的脂质体可以在一80°C保存。 小麦胚芽翻译反应图37.3比较了双层反应（bilayerreaction)和透析反应（dialysisreaction)的建立方法。双层反应利用提取物和上层缓冲液的密度差异将提取物和mRNA与其他反应物相互隔离。这种情况下，底物和产物的扩散发生在整个缓冲液界面。由于装置简单，双层无细胞翻译反应可以自动操作（Sawasakietal.2002a;Tyleretal.,2005;Vinarovetal.，2004;2006)。根据我们的结果，双层反应可以生产约0.2mg/mL的不同膜蛋白。然而，由于扩散稀释了反应，产量受到限制。 并能从50uL扩大到10mL或更大体积而不会有容积生产率(volumetricproductivity)的总体改变。这一方法可用较小的体积对少数蛋白质进行简单筛选;而对于已经通过小规模方案了解了性质并发现可以深人研究的蛋白质，也可用较大的体积进行规模化生产。采用双层和透析反应的自动批次化的无细胞翻译的实验方案都已经发表（EndoandSawasaki,2006;Sawasakietal.，2002a;Vinarovetal.,2006)。对于完整膜蛋白的翻译，我们发现加人单室脂质体能够有效的改良翻译反应（GorenandFox,2008;Nozawaetal.,2007)。 (2)向％孔U形底板的单孔中加入5卟的mRNA制备物。 (3)在每个孔中的mRNA样品中再加人20uL翻译混合物，混匀。 (4)小心加入125fxLIX覆盖缓冲液以形成双层。注意不要破坏双层结构，否则会稀释提取物并减少蛋白质产量。 (5)26°C孵育反应20h,期间不要破坏双层结构。 (6)蛋白质翻译水平可通过变性SDS-PAGE确定，肌酸激酶作为内参。 透析反应实验方案 (1)用双层反应实验方案中第（1)步描述的翻译混合物50uL溶解纯化的mRNA沉淀。 (2)将翻译混合物放入12kDaMWC◦透析杯中。 (3)制备储备透析缓冲液，混合6.5mLMilli-Q水、2.0mL5X反应缓冲液和1.5mL的2mmol/L未标记氨基酸。超声混合液5min，然后用0.2um滤器过滤。将2.5mL储备透析缓冲液加到24深孔板中的每个孔中。 (4)将透析杯悬浮到储备透析缓冲液中。注意在透析杯下不要有起泡,否则会影响添加物的补给。 (5)用Saran包装膜(Saranwrap)覆盖24深孔板以阻止储备透析缓冲液蒸发。26°C孵育翻译反应16h。 (6)蛋白质翻译水平可通过变性SDS-PAGE确定，肌酸激酶作为内参。 密度梯度超速离心纯化图37.4显示了纯化含有膜蛋白(小麦胚芽无细胞翻译技术生产)的脂蛋白体示意图。在密度梯度装配好后，一步离心可以将脂蛋白体与无细胞提取蛋白质分离开。在大多数情况下,脂蛋白体在30%Accudenz溶液和上层缓冲液的分界面被极大的浓缩。 质再水化缓冲液的分界面上。 |
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