双抗夹心法elisa后空白孔OD值高于部分样本OD值

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2021-08-06

问题描述：

不好意思，新手，好多都不懂，我做的ELISA，空白孔OD值高于部分样本，如果做曲线的话，减去空白孔OD值，算出来样本浓度，有好多负值，所以想问一下，是必须要减去空白孔OD值吗？还是只是在做曲线时标准品减去空白孔OD值，求出方程，直接代入样本OD值（样本不减空白孔），还是都不减空白孔？求大神帮忙？

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泰坦之旅

用户

这个结果是一个失败的试验1、标准品在0-31.25 范围内根本没有梯度结果呈现。原因：（1）试剂盒灵敏度不够高，（2）试剂盒显色系统不好2、样本和标准品结果几乎在一样的范围内，根本就没区分度。原因（1）试剂盒质量差，（2）试剂盒选的不够好建议以后再做类似需要做标准曲线的实验时的步骤：step1：只做试剂盒的标准曲线，观察试剂盒的标准曲线是否能够呈现良好的梯度趋势。良好的标准曲线范围如下： “0”浓度 OD值小于0.1， “中间浓度”OD值介于0.500-1.000之间， “最高浓度”OD值大于1.0，最好能到1.5~2.5。step2：试剂盒标准曲线和样本同时做，并且附带空白孔step3：选择合适的标准曲线拟合方程式，进行样本浓度计算，方程式的选择取决于你的标准曲线的走势。一般双对数方程式可以适用绝大部分的标准曲线。欢迎咨询

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lupei1988

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1、针对检测OD值没有梯度，我认为可能一是由抗体原因导致，如果这两株抗体不能配对，检测结果就会出现你呈现的结果那样；二有可能是抗体对你所测抗原的特异性不佳，也会出现不会有梯度的情况2、针对本底较高的情况，有可能是两方面因素导致，一是样本稀释液不合适，会导致非特异反应；二是抗体包被板封闭不完全，导致酶标抗体非特异吸附在板子上以上纯属个人意见，仅供参考

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泰坦之旅

用户

你标准品浓度是0的时候，出来的结果，就是阴性对照，或者空白的结果，但是你标准品浓度为0时，出来的结果OD值直接就是0.2左右，说明你的试剂盒背景信号值就是0.2左右，要计算就得把所有的数据减去你的空白值后再看数据。但是不论怎么看，你这个试验的数据都是失败的，不能说明问题。你测定的样本的结果基本上全部都是空白值。重新按照我上边说的方法再做一次，如果标准曲线还是做不出来梯度，只能更换试剂盒曲线拟合多项式也可以，只要相关系数好另外你可以把操作过程写出来，才好分析。建议你1、增加个步骤的反应时间，原来是30分钟的，延长到1小时2、增加显色时间，原来是20分钟显色时间，增加到30分钟甚至更久，但是一定注意，如果改变了实验时间，以后全部要按照同样的方式操作，否则数据没有可比性

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