| Note: Theproductisforresearchuseonly,notforuseindiagnosticortherapeuticprocedures | |
| ProductName | TFact™Smad1(Phospho-Ser465)DNA-BindingELISA |
| AssayType | DNA-BindingELISA |
| SubType | Phospho |
| DetectionMethod | Colorimetric450nm |
| Synonyms | BSP-1;BSP1;Dwarfin-A;Dwf-A;JV4-1;MADH1;MADR1;Mad-relatedprotein1;Mad1;MothersagainstDPPhomolog1;Mothersagainstdecapentaplegichomolog1;Mothers-against-DPP-related-1;SMAD1;Smad1;Transforminggrowthfactor-betasignalingprotein-1 |
| Specificity | TheTFact™Smad1(Phospho-Ser465)DNA-BindingELISAdetectsendogenouslevelsofSmad1onlywhenphosphorylatedatSer465. |
| Storage/StABIlity | 4°C/6Months |
| NCBIGeneSymbol | SMAD1 |
| DatabaseLinks | GeneID: 4086 UniProtID: Q15797 OMIM#: 601595 Unigene#: Hs.604588 |
| ApplicationImages |  |
| ImageLegend | TheTFact™Smad1DNA-BindingELISAKitsdetectactiveSmad1inJurkatandHepG2NuclearExtract.TheJurkatandHepG2cellsweregrown3daysinRPMI1640andDMEMwith10%FBSandharvestedfornuclearextract. |
AssayBiotechnology公司成立于2006年，位于美国洛杉矶。AssayBiotechnology公司有超过六千种抗体，涵盖了各种研究和应用领域。另外，AssayBiotechnology公司还拥有一千多种磷酸化抗体，同时公司正努力生产所有人类genowide抗体，针对到2015年为止出版过的调控磷酸化位点的抗体。作为可靠的高质量抗体生产商，AssayBiotechnology公司拥有多年研发经验的高级科学家确保了公司抗体的高品质，高特异性，100%的保证抗体质量。
AssayBiotechnology公司利用主要由混合抗原均一化技术和人类cDNA/EST噬菌体表面呈现文库技术两项具有自主知识产权的专有技术组成抗人类蛋白单克隆抗体大规模开发生产平台，完美地解决了传统的单克隆抗体生产耗时过长及成本过高的瓶颈。AssayBiotechnology公司可在较短的时间内将剩余的抗人类基因编码蛋白质单克隆抗体开发完，从而建立世界上第一个与人类基因库相配套的抗人类蛋白单克隆抗体库和抗原库（该抗体库和抗原库与国际上通用的GenBank相链接），并建成全球种类最多和规模最大的抗人类蛋白单克隆抗体生产体系和销售中心。
与人类基因相联系的抗体蛋白与抗原蛋白信息是有限的，并且每一个抗体与抗原蛋白相关信息都是唯一的和不可复制的，和人类基因组计划一样，谁先开发出来谁就拥有垄断优势。AssayBiotechnology公司开发出抗体库和抗原库之后，将对每一个新发现的和有价值的抗体与抗原信息申请专利保护，以后所有应用到这些抗体与抗原信息的需求者（例如药物靶点筛选）都必须向AssayBiotechnology公司购买使用许可，因而这是最新生命科学领域的战略高地。
自2006年1月成立以来，AssayBiotechnology一直是行业*的抗体生产和工程及分析技术，荧光染料，淬灭剂，重组蛋白和合成肽的全球贡献者。我们位于加利福尼亚州旧金山湾区的中心地带，致力于满足全球对医疗和学术研究中使用的高质量检测试剂盒和免疫试剂的需求，这些试剂主要构成医疗保健的基础。详细产品列表：AssayBiotech全国代理 货号产品规格OK-01004-1BB-R(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0101BD-1(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0102BD-2(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0103BD-3(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0104BD-4(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0105Betacellulin(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0106beta-NGF(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0107BMP-2(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0108CNTF(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0109CTGF(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0110CXCL-16(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0111EGF(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0112EG-VEGF(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0113Eotaxin(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0114Eotaxin-3(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0115FGF-Basic(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0116Follistatin(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0117G-CSF(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0118GM-CSF(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0119GRO/MGSA(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsA000114-3-3zeta(Phospho-Ser58)Antibody50ulA0002ADD1(Phospho-Ser726)Antibody50ulA0003AMPKalpha1/2(Phospho-Thr183/172)Antibody50ulA0004AmyloidbetaA4(Phospho-Thr743/668)Antibody50ulA0005CaMK2alpha/beta/delta(Phospho-Thr305)Antibody50ulA0006CREB(Phospho-Ser142)Antibody50ulA0007DARPP-32(Phospho-Thr75)Antibody50ulA0008EGFR(Phospho-Thr678)Antibody50ulA0009EGFR(Phospho-Thr693)Antibody50ulA0010EFNB1/2(Phospho-Tyr330)Antibody50ulA0011GABA-RB(Phospho-Ser434)Antibody50ulA0012GSK3alpha/beta(Phospho-Tyr279/216)Antibody50ulA0013HSP90B(Phospho-Ser254)Antibody50ulA0014IkappaB-beta(Phospho-Ser23)Antibody50ulA0015IkappaB-epsilon(Phospho-Ser22)Antibody50ulA0016Keratin18(Phospho-Ser33)Antibody50ulA0017Keratin8(Phospho-Ser73)Antibody50ulA0018MAPKAPK2(Phospho-Thr334)Antibody50ulA0019MEF2A(Phospho-Ser408)Antibody50ulA0020Myc(Phospho-Ser62)Antibody50ul
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1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃ 过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）。
2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃ 孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。
3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。37℃ 孵育0.5～1小时，洗涤。
4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分钟。
5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
间接法
1.用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃过夜；
2.次日洗涤3次；
3.加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤；
4.（同时做空白、阴性及阳性孔对照）于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml；
5.37℃孵育35-60分钟，洗涤；
6.’最后一遍用DDW洗涤。
其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。
如果用双抗体夹心法，第二个抗体可以用多抗，这样保证你的抗原会被结合，多抗可以直接带HRP标记或者可以用HRP标记二抗去和多抗结合。
（2）封闭：将已包被的板用洗涤液洗涤2次，每孔加入120 μL封闭液，封闭一段时间，取出，甩干备用。
（3）竞争反应：在制备好的板中每孔加入50 μL系列浓度的标准品溶液和50 μL稀释好的酶标抗体溶液，孵育一段时间。
（4）洗板：用洗涤液洗涤5次。
（5）显色反应：每孔加入显色溶液100 μL，孵育一段时间。
（6）终止：每孔各加入终止液，在酶标仪上测定各孔的吸光值。
1、重复性不好；
2、收自身抗体、嗜异性抗体等干扰，易出现假阳性；
3、不论仪器和手工操作，干扰因素较多。影响最大的是温度和时间。1、直接法（direct ELISA）将抗原直接固定在固相载体上，参加酶符号的一级抗体，即可测定抗原总量，此一级抗体的特异性非常重要。优势：操作手续简略，因无须运用二抗可防止交互反响。缺陷：实验中的一抗都得用酶符号，但不是每种抗体都适合做符号，费用相对进步。2.间接法（indirect ELISA）此测定办法与直接法相似，不一样在于一级抗体没有酶符号，改用酶符号的二级抗体去辨识一级抗体来测定抗原量。优势：二抗能够加强信号，并且有多种挑选能做不一样的测定剖析。不加酶符号的一级抗体则能保存它最多的免疫反响性。缺陷：交互反响发作的机率较高。3.双抗体夹心法（sandwich ELISA）被检测的抗原包被在两个抗体之间，其间一个抗体将抗原固定于固相载体上，即捕捉抗体。另一个则是检测抗体，此抗体可用酶符号后直接测定抗原的量；或不符号，再透过酶符号的二级抗体来测定抗原的量。这两种抗体有必要当心选择，才可防止交互反响或竞争一样的抗原联系部位。优势：高活络、高专一性，抗原无须事前纯化。缺陷：抗原必定得具有两个以上的抗体联系部位。4.竞争法（competitive ELISA）样本里的抗原（自在抗原）和纯化并固定在固相载体上的抗原（固定抗原）一同竞争一样的抗体，当样品里的自在抗原越多，就能够联系越多的抗体，而固定抗原就只能联系到较少的抗体，反之亦然。经清洁过程，洗去自在抗原和抗体的复合物，只留下固定抗原和抗体的复合物，拿来与只要固定抗原的对照组成果相比拟，依据呈色区别就可计算出样品里的抗原含量。优势：可适用比拟不纯的样本，并且数据再现性很高。缺陷：全体的敏感性和专一性都较差。本数据来源于百度地图，最终结果以百度地图最新数据为准。
1) 将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体.洗涤除去未结合的抗体及杂质.
2) 加受检标本,保温反应.标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物.洗涤除去其他未结合物质.
3) 加酶标抗体,保温反应.固相
免疫
复合物上的抗原与酶标抗体结合.彻底洗涤未结合的酶标抗体.此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关.
4) 加底物显色.固相上的酶催化底物成为有色产物.通过比色,测知标本中抗原的量.在临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如HBsAg,HBeAg,AFP,hCG等.只要获得针对受检抗原的异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法.如抗体的来源为抗血清,包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物.如应用单克隆抗体,一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗,分别用于包被固相载体和制备酶结合物.这种双位点夹心法具有很高的特异性,而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应,作一步检测.
在一步法测定中,当标本中受检抗原的含量很高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合,而不再形成"夹心复合物".类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同(参见1.3.2,图1-4),如按常法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现象被称为钩状效应(hook effect),因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落.钩状效应严重时,反应甚至可不显色而出现假阴性结果.因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质(例如血清中HBsAg,AFP和尿液hCG等)时,应注意可测范围的最高值.用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应.
假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇,例如HBsAg的a决定簇,也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物.但在HBsAg的检测中应注意亚型问题,HBsAg有adr,adw,ayr,ayw4个亚型,虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性,这也是用单抗作夹心法应注意的问题.
双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子(RF)的干扰.RF是一种自身抗体,多为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合.用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应.采用F(ab')或Fab片段作酶结合物的试剂,由于去除了Fc段,从而消除RF的干扰.双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响,已被列为这类试剂的一项考核指标(参见6.2).
双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原,但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原,因其不能形成两位点夹心.
2.2 双抗原夹心法测抗体
反应模式与双抗体夹心法类似.用特异性抗原进行包被和制备酶结合物,以检测相应的抗体.与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体.此法中受检标本不需稀释,可直接用于测定,因此其敏感度相对高于间接法.乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法.本法关键在于酶标抗原的制备,应根据抗原结构的不同,寻找合适的标记方法.
竞争法测抗体
当抗原材料中的干扰物质不易除去,或不易得到足够的纯化抗原时,可用此法检测特异性抗体.其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合.标本中抗体量越多,结合在固相上的酶标抗体愈少,因此阳性反应呈色浅于阴性反应.如抗原为高纯度的,可直接包被固相.如抗原中会有干扰物质,直接包被不易成功,可采用捕获包被法,即先包被与固相抗原相应的抗体,然后加入抗原,形成固相抗原.洗涤除去抗原中的杂质,然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应.竞争法测抗体有多种模式,可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合,抗HBc ELISA一般采用此法.另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合,洗涤后再加入酶标抗体,与结合在固相上的抗原反应.抗HBe的检测一般采用此法.
2.5 竞争法测抗原
小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点,因此不能用双抗体夹心法进行测定,可以采用竞争法模式.其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合.标本中抗原量含量愈多,结合在固相上的酶标抗原愈少,最后的显色也愈浅.小分子激素,药物等ELISA测定多用此法.
2、封闭液肯定不好
3、显色时用封口膜盖好
