Product Specifications:
Item#: 106
Description: HIV-1 Reverse Transcriptase (p66) Capture ELISA.
Storage: Store Components as specified.
Stability: See Kit Label
Note: Read instructions and familiarize yourself with kit components before performing experiments with this kit.
Some components of this kit are light sensitive. Do not expose to direct sunlight.
Component List:
A) Plate holder with solid phase capture ligand (Anti-p66 Monoclonal Antibody) strips, store at 4oC
B) Wash Buffer 10 x, store at 4oC
C) Blocking/Diluent Buffer, store at 4oC
D) Reverser Transcriptase (rp66) Reference, store at 4oC
E) Detector Reagent, store at 4oC
F) Substrate, store at 4oC
G) Stop Solution, store at 4oC
Section-1
Pre-Test Preparation
1. Bring components A, B, and C to room temperature.
2. Dilute wash buffer (Component B) 1 : 10 with deionized water for use.
3. Remove plate holder with strips from shielded bag (Use scissors to cut the sealed end of bag).
4. Add 200µl of wash buffer to each well and leave at romm temperature until ready for the next step.
Section-2
Capture Assay
1. Prepare several dilutions (minimum 200µl) of positive reference rp66 (Component D,1ug/ml ) in diluent buffer (Component C) in Eppendorf or comparable tubes - labeled accordingly: 500ng/ml to 0.5ng/ml in 4-fold serial dilutions. Note: low rp66 detection sensitivity in 100-200pg/ml or 10-20pg/test range.
2. Prepare test samples using diluent buffer (Component C) in 10-100ng/ml range. Unknown samples may be used in 1:2 to 1:10 dilution range with Diluent Buffer (Component C).
3. Continue from Section-1, Step 4: Dump contents of wells and pat dry. Set up strip well holder on a grid.
4. Pipette 100µl of positive reference (Step 1 above) and test samples into wells. Note position on the grid. Tap holder gently against table to dislodge air bubbles in wells. Cover plate and leave at RT for 1 hour.
5. Dump Contents of wells and wash 3 times with 1 x wash buffer (Component B, 300µl/well). Leave last wash until ready to add detector reagent. Pat dry wells.
6. Dilute detector reagent (Component E) 1:100 in diluent buffer (Component C). Add 100µl of detector reagent to each well. Leave plate at RT for 1 hour in dark.
7. Repeat washing as in Step 5 above, leave last wash in wells until ready to add substrate.
8. Dump contents of wells from Step 7 above.
9. Add 100µl of TMB substrate (Component F) to each well. Blue color will develop over 10 minutes at RT.
10. Stop color development (Step 9) after 10 minutes by adding 100µl of Stop Solution (Component G) to each well. Color will change to yellow. Read plate at 450nm as soon as possible (no more than 10 minutes).
Caution: Steps 6 and 10 above, plate must be left in a dark place.
STRICTLY FOR NON-HUMAN RESEARCH AND DIAGNOSTICS
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需要的仪器有：酶标仪、恒温箱、枪、枪头、烧杯、滤纸.当然有自动洗板机最好.
现在国内最差也是用3代试剂，有些地方会用4代试剂。
4代试剂（检查抗原+抗体）——窗口期为4周。因为抗原于3-4周达到复制的峰值，此时通过4代试剂检查，如果感染了HIV，抗原/抗体至少有一个为阳性，如果都是阴就排除了。
3代试剂（只查抗体）——窗口期为6周。
以上为理论分析+临床经验的结果，可以说是99.9%的准确度。
但是目前FDA、CDC和试剂生产商统一达成的共识，也就是针对普通人，最保守的窗口期是3个月。无论什么试剂，3个月都100%排除。
1．取出试剂盒室温平衡30min，取出血样放至室温。
2．配标准品：取150uL标准品加入150uL标准品稀释液稀释，依次稀释5次。
3．加样：分别于各反应孔中加入标准品50uL，样品40UL，标准品做复孔，样品做3孔。
4．分别于样品孔中加入10UL抗体。
5．标准品和样品孔中分别加入50uL链酶亲和素-HRP，盖上封板膜,轻轻震荡混匀，37℃温育60min。
6．配洗涤液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。
7．洗涤：小心揭开封板膜，弃去液体，甩干，每孔加200uL洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。
8．显色：每孔先加入显色剂A 50uL，再加显色剂B 50uL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色6min。
9． 终止：每孔加入终止液50uL，终止反应（此时蓝色立即转为黄色）。
10．测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度。测定应在加终止液10min之内进行。
11．保存结果，收拾桌面。
12．分析处理数据
注意事项
1. 取出板条前恢复到室温后再打开外包装袋，实验中不用的板条立即放回包装中，密闭封口，其余不用试剂应盖好。
2. 实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。
3．实验板孔加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应孔的孵育时间一致。
4．洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水。
5．试剂盒内试剂请在保质期内使用，不同批号试剂不要混用。
6．1000pg/ml以上的结果为非线性的，根据此标准曲线无法得到精确的结果。大于1000pg/ml 的样品应以标准稀释缓冲液稀释后重做。在结果分析时，结合考虑相应的稀释度。
DAS-ELISA试剂盒中抗体有包被抗体和酶标抗体，这两种抗体是一种抗体，前者没有酶标，后者用酶进行了标记。
NCM-ELISA一般有一抗和二抗，这两种抗体不一样，前者（一抗）一般是鼠抗体或兔抗体，没有酶标，相对应的二抗一般是羊抗鼠或羊抗兔抗体，用酶进行标记。也有用马大规模备抗体的。
TDS-ELISA是三抗体ELISA，第三级的抗体是将信号级联放大。
以上三种是比较常见的，还有其他一些试剂盒，可参考免疫学的内容。
ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
