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BAS-ELISA是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素(B)与亲和素(A)间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合。这样，结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。
BAS用于检测的基本方法可分为三大类。
第一类是标记亲和素连接生物化大分子反应体系，称BA法，或标记亲和素生物素法(LAB)。

第二类以亲和素两端分别连接生物素化大分子反应体系和标记生物素，称为桥联亲和素-生物素法(BRAB)。
第三类是将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，再与生物素化的抗抗体接触时，将抗原-抗体反应体系与ABC标记体系连成一体，称为ABC法。这一方法可以将微量抗原的信号放大成千上万倍，以便于检测。 亲和层析是将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液， 改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来。
生物素-亲和素系统可以与亲和层析的方法结合，大大提高纯化蛋白质的纯度，或者为已知配体寻找受体。步骤是首先将生物素共价结合到配体蛋白上，再将生物素化后的配体蛋白加入含有受体蛋白的混合物，然后将此混合物通过预先固定了亲和素的层析柱，这时配体受体复合物就通过生物素-亲和素系统停留在层析柱上，最后通过选择性洗脱获得此受体配体蛋白复合物或者仅有受体。这一方法被广泛运用于药物研发行业，当人们发现某种药物分子具有疗效但是又不清楚它具体作用于哪种蛋白质时，可以将其生物素化然后把靶蛋白从成千上万种蛋白质中“抓”出来。
生物素-亲和素系统还可以用相似的方法分离DNA.方法是在DNA探针的一端挂上生物素，然后用其获得目的DNA片段，再利用固定化的亲和素回收这些DNA。
传统的基因探针是由带放射性的磷酸碱基合成的，我们可以用被生物素标记的磷酸碱基合成基因探针，避免了实验过程中放射性物质可能造成的伤害。

链霉亲和素分子由4条相同的肽链组成，其氨基酸组成中，甘氨酸和丙氨酸的含量较大，而且结合生物素的活性基团也是肽链中的色氨酸残基；链霉亲和素是一种稍偏酸性（pH6.0）的蛋白质，并且不带任何糖基。在蛋白水解酶作用下，链霉亲和素可在N端10～12和C端19-21间断裂，形成的核心链霉亲和素仍然保持完整的结合生物素的能力，所以可以提高融合率。
链霉亲和素是与亲和素有相似生物学特性的一种蛋白质，是streptomyces avidinii菌的分泌物，其分子量及结合生物素的能力与鸡蛋清中的亲和素相似，等电点6.0，非特异性结合远比亲和素低。

链霉亲和素分子由4条相同的肽链组成，其氨基酸组成中，甘氨酸和丙氨酸的含量较大，而且结合生物素的活性基团也是肽链中的色氨酸残基；链霉亲和素是一种稍偏酸性（pH6.0）的蛋白质，并且不带任何糖基。在蛋白水解酶作用下，链霉亲和素可在N端10～12和C端19-21间断裂，形成的核心链霉亲和素仍然保持完整的结合生物素的能力。链霉亲和素的活性单位也是以结合1μg生物素所需的量来表示，1mg链霉亲和素的最高活性可达18U。向左转|向右转

免疫检验的自动化
华中科技大学同济医学院附属协和医院检验科---吴健民

　　随着免疫学的不断发展,新的免疫学技术不断出现,如化学发光技术、时间分辨荧光免疫测定技术、荧光偏振免疫分析测定技术等。促进了免疫检测的自动化,一大批先进的自动化免疫分析仪应运而生,它们的出现不仅减轻了工作人员的劳动强度,而且缩短了分析流程,提高了实验结果的精确度和准确性,灵敏度更是达到rlg甚至pg水平,在内分泌激素、血浆特种蛋白、肿瘤标志物、维生素、体内药物浓度的快速测定中起着重要作用。
　　各种现代化免疫分析仪都使用一种或两种新的免疫分析技术,如:酶联免疫分析技术、生物素一亲和素技术、化学发光分析技术、荧光偏振技术、时间分辨荧光免疫测定技术、电化学发光技术等,使免疫检验手段更先进、方法更可靠、结果更准确、可与放射免疫分析技术相媲美。下面就国内外常见的几种自动化免疫分析仪及其分析原理作一介绍。
一、美国雅培公司的AXSYM全自动快速免疫分析系统:该系统综合使用了微粒子捕捉酶免疫分析技术(MEIA)、荧光偏振免疫分析技术(F凹的,可测定激素、肿瘤标志物、肝炎、病毒标志物、娃娱、维生素和各种治疗药物浓度等。
　　(一)微粒子捕捉酶免疫分析技术(MEIA)原理。以双抗体夹心法为例,介绍如下:已包被了抗体的塑料微珠试剂中,加入待测标本后,经温育,再加入碱性磷酸酶标记的抗体、形成抗体一抗原一酶标记抗体复合物。然后将其转移到玻璃纤维柱上,用缓冲液洗涤,没有结合的抗原、酶标抗体被洗掉,结合抗原抗体的塑料微珠则被保留在纤维柱滤膜的上方。这时再加入底物,4-甲基伞型酣磷酸盐(4-Mup)。酶标抗体上的碱性磷酸酶将4Mup分解,脱磷酸后形成甲基伞型酣(4Mu),它在365nm激发光的照射下,发出448nm的荧光,经过荧光读数仪的记录、放大,计算出所测物质的含量。
　　荧光偏振免疫分析技术(FPIA〉,这是一种均相荧光免疫分析法,主要用于测定小分子量物质,如药物浓度测定。原理是:标记在小分子抗原上的荧光素经485m的激发偏振光照射后,吸收光能,越入激发状态,激发状态的荧光素不稳定,很快以发出光子的形式释放能量而还原。发射出的光子经过偏振仪形成525一550nm的偏振光,这一偏振光的强度与荧光素受激发时分子转动的速度呈反比,游离的荧光素标记抗原,分子小,转动速度快,激发后发射的光子散向四面八方,因此通向偏振仪的光信号很弱,而与抗体大分子结合的荧光素标记抗原,因分子大,分子的转动慢,激发后产生的荧光比较集中,因此偏振光信号比未结合时强得多。在测定过程中待测抗原小分子、荧光标记抗原小分子和特异性抗体大分子同时加入到一反应杯中,经过温育,待测抗原和荧光标记抗原竞争性地与抗体结合。待测抗原越少,与抗体竞争结合的量越少,而荧光标记抗原与抗体结合量就越多,当激发光照射时,荧光偏振的程度与荧光标记物分子转动的速度成反比,而荧光标记的小分子抗原与大分子抗体结合后,其分子的转动速度减慢,因此荧光偏振信号强。结果是待测抗原的浓度低,可以通过计算获得其含量。
二.美国拜耳公司ACS:180SE和ACS:CENTAUR全自动化学发光免疫分析系统:该系统是利用化学发光技术和磁性微粒子分离技术相结合的测定方法。以吖啶酶为发光的标记物,固相载体为极细小的磁性颗粒。其测定原理与放射免疫和酶联免疫中的双抗体夹心法和竞争结合法相似。下面以双抗体夹心法为例进行介绍。
　　(一)单克隆抗体包被磁性微粒:磁性微粒是以三氧化二铁为核心,外包一薄层聚苯乙烯组成,直径10-2OL由于磁性微粒体积小,几千万颗微粒的表面积比等量的固相载体表面积大得多,可吸附更多的抗体,同时磁性微粒的核心是铁,在磁场中很快下沉,因此容易进行洗涤和分离。
　　(二)抗原抗体结合:包被了单克隆抗体的磁性微粒中加入一定量的标本后,标本中的抗原与微粒上的抗体结合,再加上吖啶酶标记的多克隆抗体,经过温育形成固相包被抗体－抗原－吖啶酶标记抗体复合物。
　　(三)洗涤、分离:在电磁场中进行3~5次洗涤后,很快将未结合的多余抗原和标记抗体洗去。
　　(四)加入氧化剂发光:经过洗涤的磁性微粒中,加入氧化剂(H202)和pH纠正液(NaOH)使成碱性,这时吖啶酶在不需要催化剂的情况下分解、发光,由集光器和光电倍增管接收。记录5秒钟内所产生的光子能,这部分光的积分与被测抗原的量成正比,可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。
三.美国强生公司的VitrosECi全自动增强化学发光酶免分析仪系统。该系统由Arnerlite发展而来,采用酶联　　免疫技术、生物素亲和素技术和增强化学发光技术。它是用辣根过氧化物酶(HRP)标记抗原或抗体、以子弹头型塑料小孔管为固相载体,鲁米诺为化学发光剂,并加入化学发光增强剂,可使化学发光强度增强、时间延长而且稳定。下面简单介绍其工作原理。
　　(一)在链霉亲和素包被的子弹头型塑料小孔管中,加入生物素标记的特异性抗体和待测标本,经过37℃温育,链霉亲和素与生物素结合,特异性抗体与标本中的抗原结合,形成链霉亲和素一生物素一抗体一抗原复合物,经过洗涤,将多余的标本和生物素标记抗体除去。
　　(二)加入辣根过氧化物酶标记抗体,经37℃温育,形成链霉亲和素一生物素一抗体一抗原一酶标抗体复合物,并固定在小孔管壁上。
　　(三)加入氧化剂H202，增强化学发光剂和鲁米诺,这时结合在固相载体上的辣根过氧化物酶在强氧化剂的作用下将增强化学发光剂亚铁原吟琳激活,接着它催化并激活鲁米诺发光,这种化学发光强渡比单独鲁米诺发光强,持续时间长,而且稳定,易于测定。
　　(四)鲁米诺发光强度经光量子记录系统记录,经计算‘从标准曲线上得出待测抗原含量。
四.法国梅里埃公司的VIDAS全自动荧光酶标免疫测试系统。该系统以碱性磷酸酶标记抗原或抗体,用塑料吸管(SPR)为固相载体,以4-甲基伞型酬磷酸盐(4-MIjP)为发光剂,其测定原理及过程以双抗体夹心法描述如下:
　　(一)将待测标本加入多孔试剂条的样本孔内,然后将多孔试剂条插入仪器内。
　　(二)将单克隆抗体包被的塑料吸嘴SRP(其形态与加样器的吸头相似),插入多孔试剂条的上方。
　　(三)仪器自动将待测样本来回多次吸入塑料吸嘴,以促抗原抗体反应,经温育后吸入缓冲液进行洗涤。
　　(四)然后来回多次吸入碱性磷酸酶标记抗体,使塑料吸嘴内表面形成包被抗体一抗原一酶标抗体复合物,经温育后进行洗涤。
　　(五)最后加入底物4-甲基伞型酣磷酸盐,它被酶标抗体上的碱性磷酸酶分解,脱磷酸形成4-甲基伞型酣,经370nm激光照射下,发出450nm的荧光,经荧光读数仪记录,并计算出所测物质的含量
五.美国贝克曼公司(Beclunarl)的Access全自动微粒子酶放大化学发光免疫分析系统,是由美国贝克曼公司和法国巴斯德研究院合作设计生产的。该系统以碱性磷酸酶标记抗原或抗体、以磁性微粒子为固相载体,用AMPPD(Diomums)作为化学发光剂,这种化学发光剂发光稳定、持续时间长,因此比闪烁发光容易控制。其测定原理和过程简述如下:
　　(一)单克隆抗体包被磁性微粒L微粒直径<7μ(其余同ACS:180)。
　　(二)抗原抗体结合:包被单克隆抗体的磁性微粒中加入标本后,标本中的抗原与微粒表面的抗体结合,再加入碱性磷酸酶标记的抗体,经温育后形成固相包被抗体-抗原-酶标记抗体复合物。
　　(三)洗涤、分离:同ACS:180
　　(四)加入底物AMPPD发光剂:AMPPD在酶标记抗体上的碱性磷酸酶催化作用下,迅速去磷酸,生成不稳定的中介体AMPD。AMPD很快分解,从高能激发态,回到低能量的稳定态,同时发射出光子,这种化学发光持续而稳定,可达数小时之久。通过光量子阅读系统记录发光强度,并从标准曲线上计算出待测抗原的浓度。
六.美国DPC公司(Diagnosticproductscorporation)的I刷ULITE2000型全自动酶放大化学发光免疫分析系统。该系统以碱性磷酸酶标记抗原或抗体,用Dioxetarl作为发光物质,以塑料珠为固相载体。测定原理与贝克曼公司的Access基本相同。
　　发光物质Dioxetanephosphate的分子结构中有两个重要部分:一个是联接苯环和金刚炕的二氧四节环,它可以断裂并发射光子:另一个是磷酸基团,它维持着整个分子结构的稳定。当有碱性磷酸酶存在时,这种发光物质作为酶的底物,在酶催化下脱去磷酸根的基团,形成一个不稳定的中间体。这个中间体随即自行分解(二氧四节环断裂〉,同时发射光子。这种发光物质发射的光稳定,持续时间长。发光的强度与碱性磷酸酶的量成正比,因此可计算出标本中待测物质的浓度。
七.美国EG&GWallac公司的autoDELFIA全自动时间分辨荧光免疫检测系统。该系统用制系元素标记抗原或抗体作为示踪物,并与时间分辨荧光测定技术(TRFIA)相结合,建立了一种新的非放射性微量分析技术,具有灵敏度高,示踪物发光稳定,不受样品自然荧光干扰,标准曲线范围宽,检测重复性好等优点。
　　(一)制系元素荧光光谱的特点:
　　通常荧光光谱分两部分,激发光谱和发射光谱。普通物质产生的荧光光谱Stokes位移较小,因此激发光谱和发射光谱常有重叠,互相干扰。而常见的游离锅系元素荧光信号也很弱,但当它与有机配合体结合后,分子内和分子间能量传递,使荧光强度明显增强,而且稀土离子(包括制系元素)的荧光光谱有较大的Stokes位移(约290nm),使激发光谱和发射光谱不会互相重叠。另外稀土离子发射光谱的峰相当窄,特异性很强,荧光寿命长,比普通荧光高出几个数量级,因此可以采用延缓测量时间的方式来降低样品和试剂的本底荧光干扰,提高了测定的精密度。
　　(二)时间分辨荧光免疫分析法(Time-resolvedfluoroimmuneassay,TRFIA)原理:
时间分辨荧光免疫分析法使用的示踪物是三价稀土离子如:铕(Eu3+)、钐(Sm3+)、镝(Dy3+)和铽(Tb3+)等,它们可利用具有双功能基团结构的整合剂,在水溶液中与抗原分子以共轭双键结合,形成稀土离子－整合剂-抗原结合物。当标记稀土离子的抗原与待测抗原共同与抗体竞争结合,形成抗原抗体免疫复合物,其中含有标记的稀土离子,然后利用时间分辨荧光分析仪,可测出复合物中稀土离子发射荧光的强度,以此确定待测抗原的含量,也即固相竞争法。时间分辨免疫荧光分析法(TRIm)的原理是将稀土离子通过整合剂与抗体分子上的游离氨基共价结合,形成稀土离子－整合剂－抗体结合物,用于建立双抗体夹心免疫分析法。
八.瑞士罗氏公司ES300型全自动酶免分析仪。
该仪器系用酶联免疫分析技术,生物素一亲和素技术,以链霉亲和素包被的塑料管为固相载体,显色剂底物是ABTS。其测定原理和过程(以两步夹心法为例)简述如下。
　　(一)将链霉亲和素包被的聚苯乙烯塑料试管置于仪器内。
　　(二)将生物素标记的特异性抗体和待测抗原力日入链霉亲和素包被试管内,经温育,生物素和亲和素发生连接,待测抗原与特异性抗体发生结合,形成了固相包被亲和素一生物素一特异性抗体一待测抗原复合物,然后进行洗涤,去除未结合的抗原和生物素标记抗体。
　　(三)加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的特异性抗体(酶标抗体)经温育形成固相包被链霉亲和素－生物素－特异性抗体－待测抗原－酶标抗体复合物,再次进行洗涤,除去多余的酶标抗体。
　　(四)加入底物ABTS和H202，经温育,ABTS在辣根过氧化物酶的作用下,氧化呈现蓝色,然后吸入流动比色杯,经422nm的酶标仪测定获得OD值,经计算可得出待测抗原的含量。
九.瑞士罗氏公司ELECSYS1010和ELECSYS2010型全自动电化学发光免疫分析系统。该系统采用世界上最先进的电化学发光技术,生物素一亲和素技术,并以磁性微粒为固相载体。电化学发光免疫测定(ECLIA)是继放射免疫、酶联免疫、荧光免疫、化学发光免疫以后的新一代标记免疫测定技术,是电化学发光和免疫测定相结合的产物。电化学发光标记物发光的原理与一般化学发光不同,是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应。它包括电化学和化学发光两个过程。ECLIA的优点是灵敏度高,测定速度快、线性范围宽、结果稳定、自动化程度高、试剂保存期长,应用范围广等。
　　(一)电化学发光反应原理:
化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]+和电子供体三丙胺(TPA)在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。二价的[Ru(bpy)3]2+被氧化成三价,这是一种强氧化剂。TPA失去电子后被氧化成阳离子自由基TPA+·,它很不稳定,可自发地失去一个质子(H+),形成自由基TPA·,这是一种很强的还原剂,可将一个电子给兰价的[Ru(bpy)J+使其形成激发态的[Ru(bpy)3]2+·。激发态的三联吡啶钌很快发射出一个波长620nm的光子,回复成基态的三联吡啶钌。这一过程可以在电极表面周而复始地进行,产生许多光子,使光信号增强。
　　(二)电化学发光反应模式(以双抗体夹心法为例):
　　1.首先将特异性抗体包被在磁性微珠上。另外将发光剂[Ru(bpy)3]2+标记在特异性抗体上。
　　2.将待测样本与包被抗体的磁性微珠和发光剂标记的抗体共同温育,形成磁性微珠包被抗体-抗原-发光剂标记抗体复合物。
　　3.将上述复合物吸入流动室,同时加入TPA缓冲液。当磁性颗粒复合物流经电极表面时,被安装在电极下面的磁铁吸引,使[Ru(bpy)3]2+和TPA在电极表面进行电子转移,产生电化学发光。光的强度与待测抗原的浓度成正比。
　　4.这一反应模式中还可引入生物素－亲和素技术,使灵敏度更高。

亲和素生物素系统加热到95度会分离
BAS-ELISA是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素(B)与亲和素(A)间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合。这样，结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。
BAS用于检测的基本方法可分为三大类。
第一类是标记亲和素连接生物化大分子反应体系，称BA法，或标记亲和素生物素法(LAB)。

第二类以亲和素两端分别连接生物素化大分子反应体系和标记生物素，称为桥联亲和素-生物素法(BRAB)。
第三类是将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，再与生物素化的抗抗体接触时，将抗原-抗体反应体系与ABC标记体系连成一体，称为ABC法。这一方法可以将微量抗原的信号放大成千上万倍，以便于检测。 亲和层析是将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液， 改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来。
生物素-亲和素系统可以与亲和层析的方法结合，大大提高纯化蛋白质的纯度，或者为已知配体寻找受体。步骤是首先将生物素共价结合到配体蛋白上，再将生物素化后的配体蛋白加入含有受体蛋白的混合物，然后将此混合物通过预先固定了亲和素的层析柱，这时配体受体复合物就通过生物素-亲和素系统停留在层析柱上，最后通过选择性洗脱获得此受体配体蛋白复合物或者仅有受体。这一方法被广泛运用于药物研发行业，当人们发现某种药物分子具有疗效但是又不清楚它具体作用于哪种蛋白质时，可以将其生物素化然后把靶蛋白从成千上万种蛋白质中“抓”出来。
生物素-亲和素系统还可以用相似的方法分离DNA.方法是在DNA探针的一端挂上生物素，然后用其获得目的DNA片段，再利用固定化的亲和素回收这些DNA。
传统的基因探针是由带放射性的磷酸碱基合成的，我们可以用被生物素标记的磷酸碱基合成基因探针，避免了实验过程中放射性物质可能造成的伤害。

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请问电化学发光技术方法原理

抽血检测，一般用三代酶联合免疫法 酶联免疫法，简称ELISA。 它的中心就是让抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测。 步骤：ELISA用血清来检测，首先血液要经过至少半个小时的凝集，然后取血清（这是有些网友不理解为什么医院抽完了血对血置之不理的原因，其实是误会）。将酶复合物用稀释液稀释后，加血清及阴性、阳性对照，还有就是质控品（这是严格的要求，它的范围必须在质控范围内）。经过一个小时的孵育，然后洗板，加底物，半个小时避光反应后加终止液即完成反应部分，然后就是读数。由数值来判断结果的阴性或阳性。严格的讲，如果第一次检测为阳性的话，无论是哪个实验室，必须按照CDC的HIV操作规程来进行第二次检测，第二次的方法必须与第一次的不同，如还是阳性，将送确认实验室确认。有的医院很不负责，将初筛阳性的报告发出后就不管了，这是不对的。必须经过确认实验室确认后才可出阳性诊断。祝大家。PS，第一次检测为阳性的话，一定要去确认实验室再做一次，勇敢的去面对，也许结果就不一样了。 基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。 具体方法有： （一）双抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： （1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。 （2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 （3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。 （4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。 根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。 （二）双位点一步法 在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。 在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。 （三）间接法测抗体 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下： （1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。 （2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。 （3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。 （4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。 本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。 （四）竞争法 竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下： （1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。 （2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。 （3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。 （五）捕获法测IgM抗体 血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下： （1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。 （2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。 （3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。 （4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。 （5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。 （六）应用亲和素和生物素的ELISA 亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。 亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。

各位战友：
手头有一瓶生物素化的一抗，想用来做IHC，如果用相应的没有亲和素化的二抗来做的话，对结果会不会有影响呢？
谢谢！

亲和素是一种糖蛋白,可由蛋清中提取。分子量60kD,每个分子由4个亚基组成,可以和4个生物素分子亲密结合。

两者意思上有略微差别。
1.avidin
英 ['ævɪdɪn]美 ['ævədɪn]
n. [生化] 抗生物素蛋白；[生化] 卵白素；亲和素
2.streptavidin
[s,trep'tævidin]
n. 链霉亲和素；抗生蛋白链菌素