| Microarray Panel | ROS1 positive non-small cell lung carcinoma tissue microarray, containing 12 cases of adenicarcinoma, 3 squamous cell carcinoma, 2 each of cell lines and adenosquamous carcinoma, 1 mucoepidermoid carcinoma, plus 1 lung tissue, single core per block | |
| Cores | 26 |  |
| Cases | 21 | |
| Row number | 6 | |
| Column number | 5 | |
| Core Diameter (mm) | 1.5 | |
| Thickness (µm) | 5 | |
| Tissue Array Type | FFPE | |
| Species | Human | |
| Applications | Routine histology procedures including Immunohistochemistry (IHC) and In Situ Hybridization (ISH), protocols which can be found at our support page. | |
| Notes | 1. TMA slides were sectioned and stored at 4°C and may not be fresh cut, but still suitable for IHC. Please request fresh cut if experiment involves phospho-specific antibodies, RNA studies, FISH or ISH, etc. A minimum of 3 slides per TMA must be purchased to cover the cost of trimming for fresh sectioning.2. Most TMA slides were not coated with an extra layer of paraffin (tissue cores can be easily seen on the glass). To prevent tissue detachment during antigen retrieval, unbaked slides must be baked for at least 30 to 120 minutes at 60°C. before putting into xylene for de-paraffinization. Baked slides were sent out baked for 2 hours.In the following specsheet,“*” means invalid core; “-” means no applicable or negative in IHC markers. | |
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| A |  |  |  |  |  | |||
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| B |  |  |  |  |  | |||
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yyj5028
生物素和亲和素的结合部位是咪唑酮环
已修改~
下面开始更新2016的
【文章介绍】
实验是映证理论，对学生进行基本技能训练和培养科学研究能力的手段。BioRike博瑞克根据《医学免疫学实验指导》一书系统整理了14个实验项目，每个实验说明实验目的，实验原理，实验内容方法，实验要求及注意事项，希望广大师生能够从中有所收获。
BioRike简介：BioRike（中文简称“博瑞克”）是长沙达尔锋生物科技有限公司旗下的产品品牌,由旗下专业的生命科学实验室BioRike博瑞克研发和生产。BioRike是一家致力于生命科学和生物技术领域的高科技实验室，专门从事以ELISA试剂盒、抗体、细胞因子、免疫检测试剂盒、血清等免疫学产品为主的生物试剂的研发与销售。
一、酶联免疫吸附试验（ELISA）
酶联免疫吸附试验（ELISA）是将抗体（抗原）包被在固相表面后，按不同的步骤加入待测抗原（抗体）和酶标抗体（抗原），充分反应后用洗涤的方法，使固相上形成的抗原抗体复合物与其他物质分离，洗去游离的酶标抗体（抗原），最后加入底物，根据酶对底物催化的显色反应程度，而对标本中的抗原（抗体）进行定性或定量。
ELISA的技术类型有多种，常用的有间接法、夹心法和竞争法等，本次实验介绍间接法。
【实验目的】
掌握酶联免疫吸附试验的基本原理和临床意义，了解其实验操作技术。
【实验原理】
将抗原结合到固相载体上，当加入阳性标本后，相应抗体将结合到固相抗原上，利用酶标记的抗抗体可检测出标本中与固相抗原结合的抗体。
【实验材料与仪器】
抗原与抗体：伤寒O诊断菌液；待测血清；阳性对照血清；阴性对照血清；酶标抗人IgG抗体。
试剂：包被稀释液；样本稀释液；辣根过氧化物酶底物液（TMB-过氧化氢尿素液）；终止液。
【实验方法及内容】
1.包被抗原：将抗原用包被稀释液做1：20稀释，每孔加入100μl，置37℃作用4h或4℃作用24h。
2.洗涤：弃去孔中液体，用洗涤液洗3次，每次1min。于吸水纸上拍干，4℃储存备用。
3.加入待测样本：用样本稀释液对待测标本进行适当稀释，将稀释好的标本加入酶标板反应孔中，每孔100μl，置于37℃作用30min。注意应做阴性对照和阳性对照。并作复孔检测。弃去孔中液体，用洗涤液洗3次，每次1min。于吸水纸上充分拍干。
4.加入酶结合物用样本稀释液对酶结合物进行适当稀释（根据酶结合物说明书提供的参考工作稀释度进行预试确定稀释倍数），将稀释好的酶结合物加入反应孔中，每孔100μl，置于37℃作用30min。洗涤同第2步。
5.加入底物显色每孔加辣根过氧化物酶底物液100μl，置37℃蔽光显色10～20min。
6.终止反应当阳性对照出现明显颜色变化或阴性对照稍有颜色变化时，每孔加入终止液50μl终止反应，于20分钟内测定实验结果。
【实验结果与判定】
1.肉眼判定：明显显色者为阳性，不显色者为阴性。
2.酶标仪判定：采用反应底物的最大吸收波长测定OD值，本实验底物为TMB，最大吸收波长为450nm，因此应测定OD450值。
【注意事项】
1.加样本稀释液必须使用微量移液器；加入样本后必须混合均匀。
2.严格控制反应时间，洗板时严格按操作规程进行，每一操作间隔不超过10min。
【思考题】
ELISA法用于检测抗原和检测抗体的类型各有哪些？各种方法有何特点？其临床应用如何？
二、酶免疫组化技术(Enzymeimmunohistochemistrytechnique)
酶联免疫组化技术是直接以细胞或组织切片为抗原相，以酶联免疫技术检测抗原或抗体的存在与否或定位的一类酶标技术。该方法。本实验以酶免疫组化技术检测CD3为例。
【实验原理】
将组织或细胞制成切片或涂片，用酶标记的抗体检测组织细胞表面分子。本实验以CD3单克隆抗体与待检单个核细胞涂片作用，再用生物素化抗鼠IgG检测CD3单抗与待检细胞结合的情况，最后用链霉亲和素-生物素-过氧化物酶放大系统(ABC桥联法)，CD3表面分子阳性细胞将被抗体与过氧化物酶结合物结合，在底物作用下将被染成棕黄色，CD3表面分子阴性的细胞不着色。根据细胞着色的情况可以判定CD3阴性和阳性的细胞，通过细胞计数测定其阳性百分率。
【主要试剂与器材】
1.正常山羊血清。
2.抗CD3单克隆抗体。
3.生物素化羊抗鼠IgG(二抗)。
4.链霉亲和素-生物素-过氧化物酶(SABC)。
5.3,3，-二氨基联苯胶(DAB)。
6.0.0lmol/LpH7.2PBS。
7.淋巴细胞分离液。
8.丙酮。
9.玻片、吸水纸、显微镜等。
【操作方法】
1.采集外周血，以肝素抗凝。抗凝外周血经淋巴细胞分离液梯度离心，分离单个核细胞。
2.将单个核细胞制成涂片，室温风扇吹干。
3.以纯丙酮室温固定20min(干燥后可冰冻保存)。
4.滴加抗CD3单克隆抗体，37℃温育45min。
5.将生物素化羊抗鼠IgG滴加在玻片上，置湿盒中37℃温育30min，以PBS洗3次，每次3min，然后用吸水纸将细胞周围处擦干。
6.滴加试剂SABC，置湿盒中37℃温育30min。
7.加DAB显色，室温显色5～20min，用蒸馏水洗涤，加盖玻片后镜检。
【结果判断】
阳性细胞着棕黄色，在显微镜下观察，计数200个细胞，计算阳性细胞的百分率。
【注意事项】
1.洗涤应严格按要求进行。
2.各步骤尤其加入SABC后，反应时间应严格控制，否则易出现非特异性显色，产生假阳性反应。
3.观察阳性细胞需要一定的经验，需要反复练习，才能准确掌握。
【应用与评价】
CD3分子的主要功能是转导TCR特异性识别抗原所产生的活化信号，促进T细胞活化。CD3分子分布于所有成熟T淋巴细胞的的表面，是成熟T淋巴细胞的标志。本实验测定计数CD3分子阳性细胞数量有助于计数成熟T淋巴细胞的数量，反映机体细胞免疫水平。细胞免疫缺陷、细胞免疫功能不全或低下者CD3分子阳性细胞数量下降。
本法简便易行，敏感性高，使用光学显微镜即可观察结果，无需特殊仪器，一般实验室均可开展。
【思考题】
1.影响酶免疫组化方法的因素有哪些？如何保证实验的稳定性?
2.酶免疫组化方法有哪些类型?各有什么特点?
三、酶标免疫定量测定
酶联免疫吸附试验（ELISA）中待测标本的含量与底物显色呈比例关系，因此从同时与临床标本同样测定的标准抗原物质的浓度系列得到的剂量反应曲线即可得到待测抗原的浓度。本次实验学习ELISA双抗体夹心法定性检测人血清中甲胎蛋白（AFP）。
【实验原理】
将酶与抗体（或抗原）用交联剂结合起来，此种酶结合物能与相应的抗原（或抗体）发生特异性结合反应，形成酶-抗原抗体大分子复合物，此时再加入酶底物，底物被酶催化生成有色产物，最后借助反应体系的颜色变化及呈色深浅来推断样品中检测对象的有无或含量。
【试剂与器材】
1.待检患者血清。
2.抗甲胎蛋白抗体。
3.甲胎蛋白阳性和阴性血清。
4.辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗甲胎蛋白抗体。
6.磷酸盐缓冲液（PBS，PH7.4。）
7.邻笨二胺液。
8.硫酸（2M）。
9.酶标反应板、微量加样器、温箱、冰箱、酶标仪等。
10.包被稀释液（0.05mol/LNa2CO3—NaHCO3缓冲液，PH9.6）：Na2CO31.5g，NaHCO32.9g，加双蒸水至1000ml。
11.封闭液（5%小牛血清/PBS溶液）：小牛血清50ml，PBS（PH7.4）950ml。
12.洗涤液（PBST，PH7.4）：NaCl8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO4•12H2O2.9g，KCl0.2g，Tween200.5ml，加双蒸水至1000ml。
13.样本稀释液（PBS，PH7.4）NaCl8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO4•12H2O2.9g，KCl0.2g，加双蒸水至1000ml。
14.酶标第二抗体：羊抗人IgG标记HRP（1：2000）。
15.底物液（OPD—H2O2）。
16.A液（0.1mol/L柠檬酸溶液）：柠檬酸19.2g加双蒸水至1000ml。
17.B液（0.2mol/LNa2HPO4溶液）：Na2HPO4•12H2O71.7g，加双蒸水1000ml，临用前取A液24.3ml，B液25.7ml。
18.终止液（2mol/LH2SO4溶液）：双蒸水600ml，浓硫酸100ml（缓慢滴加并不断搅拌），加双蒸水至900ml。
【操作方法】
（1）包被酶标反应板：用pH9.6的碳酸盐缓冲液1：200稀释抗体，用之包被聚乙烯塑料板，每孔加0.2ml，4℃12~24h。
（2）封闭酶标反应板：弃掉包被液，用PBS洗涤3次，甩干后用5%小牛血清/PBS液封闭。放37℃40min（或4℃过夜）。封闭结束后用洗涤液洗板，并在滤纸上拍干，每孔洗3遍，每遍3min。
（3）加入待测样品及阳性对照（用PBS稀释）：将稀释好的待测血清样品加入酶标反应板中，每孔0.2ml，阳性对照样品亦相应稀释。置于37℃温箱0.5~1h。弃去孔中液体，用洗涤液洗涤3遍，每遍3min。
（4）加酶标二抗（用PBS稀释）：加入辣根过氧化物酶标记的抗甲胎蛋抗体，每孔0.2ml置于37℃温箱，30~45min。弃去孔中液体，拍干，每孔洗涤3遍，每遍3min。
（5）加入底物液：取底物液A液24.3ml，B液25.7ml，加双蒸水50ml得pH5.0的磷酸-枸缘酸缓冲液100ml。再加入邻苯二胺40mg，充分溶解，最后加入30%H2O20.15ml。每孔加入底物液100μl。避光室温作用5~10min。
（6）终止反应：当阳性对照出现明显颜色变化后，每孔加入终止液50μl终止反应。
【结果分析】
1.目测：根据显色深浅，用（-）为无色，（+）为浅色，（++）为黄色，（+++）为棕黄色表示。一般呈++以上者为阳性。
2.酶标仪测定：在492nm波长下测OD值。
【注意事项】
1.封闭时注意将封闭液加满各反应孔，并去除各孔中可能产生的贴孔壁气泡。
2.加洗涤液时，每孔加满，但不要溢出。
3.每次洗涤液在孔中的停留时间不应少于1分钟。
4.洗涤后板要甩干，不要残留液体。
四、免疫荧光技术
荧光免疫技术是以荧光物质标记的特异性抗体或抗原作为标准试剂，用于相应抗原或抗体的分析鉴定和定量测定。荧光免疫技术包括荧光抗体染色技术和荧光免疫测定两大类。荧光抗体染色技术是用荧光抗体对细胞、组织切片或其他标本中的抗原或抗体进行鉴定和定位检测，可在荧光显微镜下直接观察结果，称为荧光免疫显微技术，或是应用流式细胞仪进行自动分析检测，称为流式荧光免疫技术。荧光免疫测定主要有时间分辨荧光免疫测定和荧光偏振免疫测定等。本次实验以荧光免疫显微技术检测抗核抗体(ANA)为例进行实习。
【实验原理】
以小鼠肝细胞或某些培养细胞(如Hep-2)作抗原片，将病人血清加到抗原片上。如果血清中含有ANA，就会与细胞核成分特异性结合。加入荧光素标记的抗人IgG抗体又可与ANA结合，在荧光显微镜下可见细胞核部位呈现荧光。
【试剂与器材】
1.抗原片：现多用商品试剂。如需自行制备，方法如下：
(1)肝印片制备：取4-8周龄小鼠，断颈杀死后，剖腹取肝。将肝脏剪成平面块，用生理盐水洗去血细胞，用滤纸吸干渗出的浆液。将切面轻压于载玻片上，使其在载玻片上留下薄层肝细胞。冷风吹干，乙醇固定，冰箱可保存1周。
(2)Hep-2细胞抗原片制备：Hep-2细胞是建株的人喉癌上皮细胞。经适宜培养在载玻片上形成单层细胞抗原片，用洗涤洗去培养基。干燥后，用无水乙醇固定。
(3)肝切片制备：取小鼠肝组织作冰冻切片，厚4μl。-30℃保存备用。
2.异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗人IgG抗体(FITC-抗人IgG抗体)有商品供应，临用时按效价稀释。
3.0.01mol/LpH7.2PBS
4.缓冲甘油取甘油9份加PBS1份。
5.待测血清、阳性和阴性对照血清临床标本筛选获得。
6.器材荧光显微镜、孵箱、有盖湿盒、染色缸、吸管、试管等。
【操作方法】
1.准备：检查加样板，生物载片恢复室温，标记。
2.稀释：PBS-Tween缓冲液稀释血清，设阴阳性对照。
3.加样：加样板放于泡沫塑料板上，加25μl稀释后血清，至加样板的每一反应区，避免气泡。加完所有标本后开始温育。
4.温育：将生物薄片盖于加样板的凹槽里，反应开始，室温温育30分钟。
5.冲洗：用烧杯盛PBS-Tween缓冲液流水冲洗生物薄片，然后立即将其浸入盛有PBS-Tween缓冲液的小杯中至少1分钟。不必混摇。
6.加样：滴加20μl荧光素标记的抗人球蛋白（结合物）至一洁净加样板的反应区，完全加完方可继续温育。荧光素标记的抗人球蛋白用前需混匀并以PBS-Tween缓冲液稀释。
7.冲洗：用烧杯盛PBS-Tween缓冲液流水冲洗生物薄片，然后立即将其浸入盛有PBS-Tween缓冲液的小杯中至少1分钟。不必混摇。
8.封片：将盖片直接放于泡沫塑料板凹槽中，滴加甘油/PBS至盖片：每反应区约10μl。从PBS-Tween缓冲液中取出1张生物薄片，用纸擦干背面和四边。还要擦拭反应区间隙。将生物薄片面朝下放在已准备好的盖玻片上，立即查看并调整使盖片嵌入载片的凹槽中。然后继续下1张。
【结果判定】
1.细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞，不发荧光为阴性。抗原片中出现阳性染色细胞为ANA阳性，否则为阴性。阳性待检血清可作进一步稀释后测定效价。
2.根据细胞核着染色荧光的图像，可区分为：
①均质型：细胞核呈均匀一致的荧光；
②周边型(核膜型)：细胞核周围呈现荧光；
③斑点型(颗粒型)：细胞核内呈现斑点状荧光；
④核仁型：核仁部分呈现荧光。
⑤混合型：两种以上核染色；
⑥应用细胞片做抗原片可检出着点型(ACA)
【注意事项】
1.PBS-Tween缓冲液在4℃下可存放两周。
2.根据每次实验的标本量决定需要稀释的FITC标记的抗人球蛋白的量，稀释后可在4℃下可存放1周。
3.血清或FITC标记的抗人Ig应滴加至加样板上，不能直接滴到载片上。
4.载片盖到加样板上后，确保反应区与液滴完全接触后，才开始记时温育。
5.冲洗载片时水流要缓慢，以免冲洗掉基质。载片上的反应区应保持湿润，不要将载片风干。
6.封片进不可用力挤压盖玻片，以免损坏基质。可左右挪动盖玻片以使其正确嵌入载片凹槽里。
7.封片介质含有荧光稳定剂，应保存在2-8℃。封好的载片可于4℃长期保存。
【实验讨论】
方法评价：间接免疫荧光技术是检测ANA最常用的方法。该方法简便、敏感，且可根据核染色形态确定核抗原的类型。
鼠肝印片细胞分布不均匀，多有重叠，冲洗时易丢失。Hep-2细胞具有核大、有丝分裂旺盛、核内细胞器较明显、具备人源性抗原的特征，对诊断和鉴别不同类型的自身免疫病十分有利。
五、斑点金免疫渗滤试验
斑点金免疫渗滤试验（dotimmunogoldfiltrationassayDIGFA）又称滴金免疫测定法，简称“滴金法”。因其最大的特点是简便、快速，故称为快速斑点免疫结合试验。本次实验以双抗体夹心法测定尿中HCG为例进行实习。
【实验原理】
选取二株抗HCG不同决定簇的抗体其中一株抗HCG抗体用胶体金标记，制备成抗HCG免疫复合物；另一株抗HCG抗体吸附ＮＣ膜表面形成斑点。当滴加在膜上的标本液体渗滤过NC膜时，标本中所含HCG被膜上抗HCG抗体捕获，其余无关蛋白等滤出NC膜片。其后加入的抗HCG免疫金复合物也在渗滤中与已结合在膜上的HCG相结合。因胶体金本身呈红色阳性反映即在膜中央显示红色斑点，斑点颜色的深浅与标本中HCG量呈正相关。
【试剂与器材】
1.标本：孕妇尿。
2.试剂盒：包括抗原参照标准液（HCG５０mU╱ml）、抗HCG免疫金复合物、洗涤液（0.02mol╱LPH7.2PBS）、滴金法反应板（由塑料小盒、吸水垫料和吸附抗HCG抗体的ＮＣ膜组成），有商品供应。
3.器材：试管、微量移液器等。
【操作方法】
1.取滴金法反应板平放于实验台上，于小孔内分别标明“Ｔ”和“Ｒ”。
2.在“Ｒ”孔内滴加抗原参照标准液６滴在“Ｔ”孔内滴加尿液标本６滴，待完全渗入。
3.每孔滴加抗HCG免疫金复合物液３滴与NC膜上待完全渗入。
4.每孔加洗涤液３滴待完全渗入。
5.目测观察结果。
【结果判断】
1.抗原参照标准液孔膜上应有清晰的淡红色斑点出现。
2.若标本滴加孔膜上无红色斑点，或斑点显色浅于参照标准液孔，说明标本中HCG含量低于５０mU╱ml；如标本孔斑点深于参照孔，则标本中含HCG含量大于５０mU╱ml。
3.若测定标本为强阳性时，可用洗涤液稀释，按同样的方法测定，稀释至标本斑点与参照孔颜色相当，即可知标本HCG含量（５０mU╱ml×稀释倍数）。
六、斑点免疫层析试验
斑点免疫层析试验（dotimmunochromatographicassay,DICA）又称免疫层析试验，简称“一步金法”。试验所用试剂全部为干试剂，多个试剂被结合在一起约6mm×70mm的塑料板条上，试纸条两端附有吸水材料，成为单一试剂条，本次实验以双抗体夹心法测定尿HCG为例进行实习。
【实验原理】
抗HCG免疫金复合物干片粘贴在近下端，抗HCG单克隆抗体和抗小鼠IgG抗体分别固化于NC膜的测试区和质控参照区。当试纸条下端浸入液体标本中，下端吸水材料即吸取液体液体向上端移动，流经干片时，使免疫金复合物复溶，并带动其向膜条渗移。若标本中有HCG，可与抗HCG免疫金复合物结合。此抗原抗体复合物流至测试区时即被固相抗体所获，在膜上显出红色反应线条。
【试剂与仪器】
1.标本：孕妇尿。
2.“一步金法”早早孕妊娠诊断试剂条片，有商品供应。
3.尿液收集杯等。
【操作方法】
将试剂条下端标志部插入尿液中10s左右，取出后放平，置室温下下３min，目测观察结果。
【结果判断】
若出现两条紫红色线为HCG阳性（妊娠），若只出现质控参照线显示紫红色为阴性（未妊娠）。
【实验讨论】
强阳性尿液中HCG含量较多，因此质控线可能不出现或极浅淡，而仅在反应区显示淡紫色条带。应避免试纸条一端插入尿液过深或过浅，插入时间过长或过短也会影响试验结果。
【BioRike博瑞克官网】www.biorike.com；www.darfun.cn
华中科技大学同济医学院附属协和医院检验科---吴健民
随着免疫学的不断发展,新的免疫学技术不断出现,如化学发光技术、时间分辨荧光免疫测定技术、荧光偏振免疫分析测定技术等。促进了免疫检测的自动化,一大批先进的自动化免疫分析仪应运而生,它们的出现不仅减轻了工作人员的劳动强度,而且缩短了分析流程,提高了实验结果的精确度和准确性,灵敏度更是达到rlg甚至pg水平,在内分泌激素、血浆特种蛋白、肿瘤标志物、维生素、体内药物浓度的快速测定中起着重要作用。
各种现代化免疫分析仪都使用一种或两种新的免疫分析技术,如:酶联免疫分析技术、生物素一亲和素技术、化学发光分析技术、荧光偏振技术、时间分辨荧光免疫测定技术、电化学发光技术等,使免疫检验手段更先进、方法更可靠、结果更准确、可与放射免疫分析技术相媲美。下面就国内外常见的几种自动化免疫分析仪及其分析原理作一介绍。
一、美国雅培公司的AXSYM全自动快速免疫分析系统:该系统综合使用了微粒子捕捉酶免疫分析技术(MEIA)、荧光偏振免疫分析技术(F凹的,可测定激素、肿瘤标志物、肝炎、病毒标志物、娃娱、维生素和各种治疗药物浓度等。
(一)微粒子捕捉酶免疫分析技术(MEIA)原理。以双抗体夹心法为例,介绍如下:已包被了抗体的塑料微珠试剂中,加入待测标本后,经温育,再加入碱性磷酸酶标记的抗体、形成抗体一抗原一酶标记抗体复合物。然后将其转移到玻璃纤维柱上,用缓冲液洗涤,没有结合的抗原、酶标抗体被洗掉,结合抗原抗体的塑料微珠则被保留在纤维柱滤膜的上方。这时再加入底物,4-甲基伞型酣磷酸盐(4-Mup)。酶标抗体上的碱性磷酸酶将4Mup分解,脱磷酸后形成甲基伞型酣(4Mu),它在365nm激发光的照射下,发出448nm的荧光,经过荧光读数仪的记录、放大,计算出所测物质的含量。
荧光偏振免疫分析技术(FPIA〉,这是一种均相荧光免疫分析法,主要用于测定小分子量物质,如药物浓度测定。原理是:标记在小分子抗原上的荧光素经485m的激发偏振光照射后,吸收光能,越入激发状态,激发状态的荧光素不稳定,很快以发出光子的形式释放能量而还原。发射出的光子经过偏振仪形成525一550nm的偏振光,这一偏振光的强度与荧光素受激发时分子转动的速度呈反比,游离的荧光素标记抗原,分子小,转动速度快,激发后发射的光子散向四面八方,因此通向偏振仪的光信号很弱,而与抗体大分子结合的荧光素标记抗原,因分子大,分子的转动慢,激发后产生的荧光比较集中,因此偏振光信号比未结合时强得多。在测定过程中待测抗原小分子、荧光标记抗原小分子和特异性抗体大分子同时加入到一反应杯中,经过温育,待测抗原和荧光标记抗原竞争性地与抗体结合。待测抗原越少,与抗体竞争结合的量越少,而荧光标记抗原与抗体结合量就越多,当激发光照射时,荧光偏振的程度与荧光标记物分子转动的速度成反比,而荧光标记的小分子抗原与大分子抗体结合后,其分子的转动速度减慢,因此荧光偏振信号强。结果是待测抗原的浓度低,可以通过计算获得其含量。
二.美国拜耳公司ACS:180SE和ACS:CENTAUR全自动化学发光免疫分析系统:该系统是利用化学发光技术和磁性微粒子分离技术相结合的测定方法。以吖啶酶为发光的标记物,固相载体为极细小的磁性颗粒。其测定原理与放射免疫和酶联免疫中的双抗体夹心法和竞争结合法相似。下面以双抗体夹心法为例进行介绍。
(一)单克隆抗体包被磁性微粒:磁性微粒是以三氧化二铁为核心,外包一薄层聚苯乙烯组成,直径10-2OL由于磁性微粒体积小,几千万颗微粒的表面积比等量的固相载体表面积大得多,可吸附更多的抗体,同时磁性微粒的核心是铁,在磁场中很快下沉,因此容易进行洗涤和分离。
(二)抗原抗体结合:包被了单克隆抗体的磁性微粒中加入一定量的标本后,标本中的抗原与微粒上的抗体结合,再加上吖啶酶标记的多克隆抗体,经过温育形成固相包被抗体－抗原－吖啶酶标记抗体复合物。
(三)洗涤、分离:在电磁场中进行3~5次洗涤后,很快将未结合的多余抗原和标记抗体洗去。
(四)加入氧化剂发光:经过洗涤的磁性微粒中,加入氧化剂(H202)和pH纠正液(NaOH)使成碱性,这时吖啶酶在不需要催化剂的情况下分解、发光,由集光器和光电倍增管接收。记录5秒钟内所产生的光子能,这部分光的积分与被测抗原的量成正比,可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。
三.美国强生公司的VitrosECi全自动增强化学发光酶免分析仪系统。该系统由Arnerlite发展而来,采用酶联 免疫技术、生物素亲和素技术和增强化学发光技术。它是用辣根过氧化物酶(HRP)标记抗原或抗体、以子弹头型塑料小孔管为固相载体,鲁米诺为化学发光剂,并加入化学发光增强剂,可使化学发光强度增强、时间延长而且稳定。下面简单介绍其工作原理。
(一)在链霉亲和素包被的子弹头型塑料小孔管中,加入生物素标记的特异性抗体和待测标本,经过37℃温育,链霉亲和素与生物素结合,特异性抗体与标本中的抗原结合,形成链霉亲和素一生物素一抗体一抗原复合物,经过洗涤,将多余的标本和生物素标记抗体除去。
(二)加入辣根过氧化物酶标记抗体,经37℃温育,形成链霉亲和素一生物素一抗体一抗原一酶标抗体复合物,并固定在小孔管壁上。
(三)加入氧化剂H202，增强化学发光剂和鲁米诺,这时结合在固相载体上的辣根过氧化物酶在强氧化剂的作用下将增强化学发光剂亚铁原吟琳激活,接着它催化并激活鲁米诺发光,这种化学发光强渡比单独鲁米诺发光强,持续时间长,而且稳定,易于测定。
(四)鲁米诺发光强度经光量子记录系统记录,经计算‘从标准曲线上得出待测抗原含量。
四.法国梅里埃公司的VIDAS全自动荧光酶标免疫测试系统。该系统以碱性磷酸酶标记抗原或抗体,用塑料吸管(SPR)为固相载体,以4-甲基伞型酬磷酸盐(4-MIjP)为发光剂,其测定原理及过程以双抗体夹心法描述如下:
(一)将待测标本加入多孔试剂条的样本孔内,然后将多孔试剂条插入仪器内。
(二)将单克隆抗体包被的塑料吸嘴SRP(其形态与加样器的吸头相似),插入多孔试剂条的上方。
(三)仪器自动将待测样本来回多次吸入塑料吸嘴,以促抗原抗体反应,经温育后吸入缓冲液进行洗涤。
(四)然后来回多次吸入碱性磷酸酶标记抗体,使塑料吸嘴内表面形成包被抗体一抗原一酶标抗体复合物,经温育后进行洗涤。
(五)最后加入底物4-甲基伞型酣磷酸盐,它被酶标抗体上的碱性磷酸酶分解,脱磷酸形成4-甲基伞型酣,经370nm激光照射下,发出450nm的荧光,经荧光读数仪记录,并计算出所测物质的含量
五.美国贝克曼公司(Beclunarl)的Access全自动微粒子酶放大化学发光免疫分析系统,是由美国贝克曼公司和法国巴斯德研究院合作设计生产的。该系统以碱性磷酸酶标记抗原或抗体、以磁性微粒子为固相载体,用AMPPD(Diomums)作为化学发光剂,这种化学发光剂发光稳定、持续时间长,因此比闪烁发光容易控制。其测定原理和过程简述如下:
(一)单克隆抗体包被磁性微粒L微粒直径<7μ(其余同ACS:180)。
(二)抗原抗体结合:包被单克隆抗体的磁性微粒中加入标本后,标本中的抗原与微粒表面的抗体结合,再加入碱性磷酸酶标记的抗体,经温育后形成固相包被抗体-抗原-酶标记抗体复合物。
(三)洗涤、分离:同ACS:180
(四)加入底物AMPPD发光剂:AMPPD在酶标记抗体上的碱性磷酸酶催化作用下,迅速去磷酸,生成不稳定的中介体AMPD。AMPD很快分解,从高能激发态,回到低能量的稳定态,同时发射出光子,这种化学发光持续而稳定,可达数小时之久。通过光量子阅读系统记录发光强度,并从标准曲线上计算出待测抗原的浓度。
六.美国DPC公司(Diagnosticproductscorporation)的I刷ULITE2000型全自动酶放大化学发光免疫分析系统。该系统以碱性磷酸酶标记抗原或抗体,用Dioxetarl作为发光物质,以塑料珠为固相载体。测定原理与贝克曼公司的Access基本相同。
发光物质Dioxetanephosphate的分子结构中有两个重要部分:一个是联接苯环和金刚炕的二氧四节环,它可以断裂并发射光子:另一个是磷酸基团,它维持着整个分子结构的稳定。当有碱性磷酸酶存在时,这种发光物质作为酶的底物,在酶催化下脱去磷酸根的基团,形成一个不稳定的中间体。这个中间体随即自行分解(二氧四节环断裂〉,同时发射光子。这种发光物质发射的光稳定,持续时间长。发光的强度与碱性磷酸酶的量成正比,因此可计算出标本中待测物质的浓度。
七.美国EG&GWallac公司的autoDELFIA全自动时间分辨荧光免疫检测系统。该系统用制系元素标记抗原或抗体作为示踪物,并与时间分辨荧光测定技术(TRFIA)相结合,建立了一种新的非放射性微量分析技术,具有灵敏度高,示踪物发光稳定,不受样品自然荧光干扰,标准曲线范围宽,检测重复性好等优点。
(一)制系元素荧光光谱的特点:
通常荧光光谱分两部分,激发光谱和发射光谱。普通物质产生的荧光光谱Stokes位移较小,因此激发光谱和发射光谱常有重叠,互相干扰。而常见的游离锅系元素荧光信号也很弱,但当它与有机配合体结合后,分子内和分子间能量传递,使荧光强度明显增强,而且稀土离子(包括制系元素)的荧光光谱有较大的Stokes位移(约290nm),使激发光谱和发射光谱不会互相重叠。另外稀土离子发射光谱的峰相当窄,特异性很强,荧光寿命长,比普通荧光高出几个数量级,因此可以采用延缓测量时间的方式来降低样品和试剂的本底荧光干扰,提高了测定的精密度。
(二)时间分辨荧光免疫分析法(Time-resolvedfluoroimmuneassay,TRFIA)原理:
时间分辨荧光免疫分析法使用的示踪物是三价稀土离子如:铕(Eu3+)、钐(Sm3+)、镝(Dy3+)和铽(Tb3+)等,它们可利用具有双功能基团结构的整合剂,在水溶液中与抗原分子以共轭双键结合,形成稀土离子－整合剂-抗原结合物。当标记稀土离子的抗原与待测抗原共同与抗体竞争结合,形成抗原抗体免疫复合物,其中含有标记的稀土离子,然后利用时间分辨荧光分析仪,可测出复合物中稀土离子发射荧光的强度,以此确定待测抗原的含量,也即固相竞争法。时间分辨免疫荧光分析法(TRIm)的原理是将稀土离子通过整合剂与抗体分子上的游离氨基共价结合,形成稀土离子－整合剂－抗体结合物,用于建立双抗体夹心免疫分析法。
八.瑞士罗氏公司ES300型全自动酶免分析仪。
该仪器系用酶联免疫分析技术,生物素一亲和素技术,以链霉亲和素包被的塑料管为固相载体,显色剂底物是ABTS。其测定原理和过程(以两步夹心法为例)简述如下。
(一)将链霉亲和素包被的聚苯乙烯塑料试管置于仪器内。
(二)将生物素标记的特异性抗体和待测抗原力日入链霉亲和素包被试管内,经温育,生物素和亲和素发生连接,待测抗原与特异性抗体发生结合,形成了固相包被亲和素一生物素一特异性抗体一待测抗原复合物,然后进行洗涤,去除未结合的抗原和生物素标记抗体。
(三)加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的特异性抗体(酶标抗体)经温育形成固相包被链霉亲和素－生物素－特异性抗体－待测抗原－酶标抗体复合物,再次进行洗涤,除去多余的酶标抗体。
(四)加入底物ABTS和H202，经温育,ABTS在辣根过氧化物酶的作用下,氧化呈现蓝色,然后吸入流动比色杯,经422nm的酶标仪测定获得OD值,经计算可得出待测抗原的含量。
九.瑞士罗氏公司ELECSYS1010和ELECSYS2010型全自动电化学发光免疫分析系统。该系统采用世界上最先进的电化学发光技术,生物素一亲和素技术,并以磁性微粒为固相载体。电化学发光免疫测定(ECLIA)是继放射免疫、酶联免疫、荧光免疫、化学发光免疫以后的新一代标记免疫测定技术,是电化学发光和免疫测定相结合的产物。电化学发光标记物发光的原理与一般化学发光不同,是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应。它包括电化学和化学发光两个过程。ECLIA的优点是灵敏度高,测定速度快、线性范围宽、结果稳定、自动化程度高、试剂保存期长,应用范围广等。
(一)电化学发光反应原理:
化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]+和电子供体三丙胺(TPA)在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。二价的[Ru(bpy)3]2+被氧化成三价,这是一种强氧化剂。TPA失去电子后被氧化成阳离子自由基TPA+·,它很不稳定,可自发地失去一个质子(H+),形成自由基TPA·,这是一种很强的还原剂,可将一个电子给兰价的[Ru(bpy)J+使其形成激发态的[Ru(bpy)3]2+·。激发态的三联吡啶钌很快发射出一个波长620nm的光子,回复成基态的三联吡啶钌。这一过程可以在电极表面周而复始地进行,产生许多光子,使光信号增强。
(二)电化学发光反应模式(以双抗体夹心法为例):
1.首先将特异性抗体包被在磁性微珠上。另外将发光剂[Ru(bpy)3]2+标记在特异性抗体上。
2.将待测样本与包被抗体的磁性微珠和发光剂标记的抗体共同温育,形成磁性微珠包被抗体-抗原-发光剂标记抗体复合物。
3.将上述复合物吸入流动室,同时加入TPA缓冲液。当磁性颗粒复合物流经电极表面时,被安装在电极下面的磁铁吸引,使[Ru(bpy)3]2+和TPA在电极表面进行电子转移,产生电化学发光。光的强度与待测抗原的浓度成正比。
4.这一反应模式中还可引入生物素－亲和素技术,使灵敏度更高。
亲和素（avidin，AV）亦称抗生物素蛋白、卵白素，是从卵白蛋白中提取的一种由4个相同亚基组成的碱性糖蛋白，分子量为68kD，等电点pI=10.5；耐热并耐受多种蛋白水解酶的作用．尤其是与生物素结合后，稳定性更好。生物素与亲和素间的作用是目前已知强度最高的非共价作用，亲和常数（K）为1015mol/L，比抗原与抗体间的亲和力（K=10.5～11L/mol）至少高1万倍。并且，二者的结合稳定性好专一性强，不受试剂浓度，PH环境，抑或蛋白变性剂等有机溶剂影响。由于每个亲和素能结合4个分子的生物素，这一特点可以用于构建一个多层次信号放大系统。因此，BAS即可用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测及定位观察研究，亦可制成亲和介质用于上述各类反应体系中反应物的分离、纯化。
亲和素由于带有一个糖链侧链，导致容易和细胞表面的多糖发生非特异性亲和。因此，链霉亲和素被开发出来。
链霉亲和素（streptavidin，SA）是由链霉菌streptomyces avidinii分泌的一种蛋白质，分子量为65kD。链霉亲和素分子由4条相同的肽链组成，其中每条肽链都能结合一个生物素，并且不带任何糖基，因此与亲和素一样，一个链霉亲和素分子也能结合4个生物素分子，二者亲和常数（K）亦为1015mol/L。链霉亲和素的适用范围比亲和素更为广泛。向左转|向右转
链霉亲和素(streptavidin下称SA)是与亲和素(svidin下称AV)有相似生物学特性的一种蛋白质。
链霉亲和素(SA)是streptomyces avidinii菌的分泌物，其分子量及结合生物素的能力与鸡蛋清中的亲和素相似，等电点6.0，非特异性结合远比亲和素低。
一 、来源：SA 是Streptomyces avicllrdi菌培养过程中的分泌产物，主要通过2一亚氨基生物索亲和层析法提纯，1L培养液中含蛋白1 0~60mg 。
二、分子量 ：链霉亲和素是四聚体蛋白，大小为66KDa。一分子链霉亲和素可以高度特异性地与四分子生物素结合，两者之间的亲和力极为强烈，链霉亲和素-生物素复合物的解离常数处于 10 mol/L 数量级，这一性质常用于分子生物学用途[1]。其中一条完整的SA肽链中有159个氨基酸残基，分子量为16450。
三、比消光系数：消光系数与蛋白中Tyr含量有关， 由于SA 中Tyr的含量比AV 多，所以SA的比消光系数也较AV 为高，两者分别为E 1mg/ml=3．40和E1mg/ml=1.57。在282nm 上这两种蛋白结合生物素后并不改变其消光系数，而在233nm上，它们结合生物素后郡便其消光系数值增高，现在一般都是利用蛋白的这种吸光特点来测定它们的活性。
