
Target | 14-3-3 protein eta |
Clonality | Polyclonal |
Reactivity | Human, Mouse |
Tested Applications | ELISA, WB, IHC |
Host | Rabbit |
Recommended dilutions | WB: 1/500 - 2000, IHC: 1/20 - 1/200. Optimal dilutions/concentrations should be determined by the end user. |
Conjugation | Unconjugated |
Immunogen | Recombinant Human 14-3-3 protein eta protein (4-246AA). |
Isotype | IgG |
Form | Liquid |
Purity | > 95% |
Purification | Protein G. |
Storage | Aliquot and store at -20°C. Avoid repeated freeze/thaw cycles. |
UniProt Primary AC | Q04917 (UniProt, ExPASy) |
UniProt Entry Name | 1433F_HUMAN |
Gene Symbol | YWHAH |
GeneID | 7533 |
OMIM | 113508 |
KEGG | hsa:7533 |
String | 9606.ENSP00000248975 |
Buffer | 0.01 M PBS, pH 7.4, 0.03% Proclin-300 and 50% Glycerol. |
Availability | Shipped within 5-10 working days. |
Note | This product is for research use only. |
Abbexa是一家致力于为生命科学研究、药物研发及生物技术公司提供优质抗体、蛋白及检测试剂盒等产品的高科技生物技术公司。基于剑桥大学研发技术优势,Abbexa提供包括一抗、二抗、纯化蛋白、ELISA试剂盒、各种酶类及其它多种试剂与研究工具的大量生命科学研究产品。
目前Abbexa的产品涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、纯化蛋白质及生物试剂,此外,为满足研发人员特殊的实验需要,Abbexa还提供抗体/多肽定制服务。严格的质控标准保证了Abbex产品的高性能,如您对产品不满意,Abbexa将直接提供退/换货服务
CLIAKits 化学发光免疫分析(chemiluminescenceimmunoassay,CLIA) RNAInterferenceProducts RNA干扰试剂 RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。基因沉默,主要有转录前水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类:TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录;PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。有时转基因会同时导致TGS和PTGS。 由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达,(长度超过三十的dsRNA会引起干扰素毒性)所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。 1. RNAi抑制转座子活性 两方面的证据提示转座子活性的抑制与siRNA有关 ①发现蠕虫mut-7基因参与RNAi并且与转座子的转座抑制有关; ②在果蝇中,参与RNAi的RNA解螺旋酶Spindle-E的突变将导致该基因引起的基因沉默的缺失,同时提高了反转录转座子活性。 2. RNAi抵御病毒感染 在拟南芥中研究转基因引起基因沉默时发现,sgs2/sde1基因突变的拟南芥对病毒的侵染表现出高度的敏感性。 3. RNAi参与异染色质的形成和维持 Hall等研究表明,着丝粒同源重复序列和RNAi组分一起正负调节着异染色质的形成并共同促使异染色质组装成核;Vople等在敲除裂殖酵母(S.pombe)的RNAi途径基因(如Argonaute、Dicer、RDRP)时发现异染色质转录得到的dsRNA可以在RNAi途径的参与下,加工成siRNA,siRNA募集异染色质蛋白1(HP1),然后靶向性引起相应异染色质区域的转基因沉默。 4. RNAi参与机体的发育调控及生理代谢 RNAi只抑制转录后的基因,所以RNAi在生物体发育学研究中具有优势。Chuang等用RNAi技术进一步证实了AG、CLV3、AP1、PAN等已知功能基因在拟南芥花发育过程中的功能。在RNAi过程中形成的RISC复合物可根据不同情况分别利用siRNA或stRNA行使不同的功能,但最终均导致特定基因沉默。 IsotypeControl 同型对照 同型对照(IsotypeControl),使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白,用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。 同型对照 同型对照的主要目的是确定一抗的结合是特异性的,而不是非特异性的Fc受体或与其他蛋白的相互作用。还可以用来竞争性的结合抗体,与功能阻断抗体发挥同样的功能。 同型对照要与一抗的来源,Ig分型和标记完全一致。 如果一抗是多抗,可以用annormalserum(与一抗相同的正常血清)(mustbethesamespeciesasprimaryantibody)。Thiscontroliseasytoachieveandcanbeusedroutinelyinimmunohistochemicalstaining.这个可以咨询试剂商。同型对照为免疫荧光标记中的阴性对照。由于荧光标记单抗的组来源不同,应选用相同来源的未标记单抗作为同型对照来调整背景染色。举个例子:比如检测一抗为单抗的mouseantiratCD11b,cloneOX-42purifiedIgG,那么它的isotype是mouseIgG2a,所以可以用purified(纯化的)mouseIgG2a来做OX-42的同型对照(IsotypeControl)。一般的的生物技术公司和国内的代理都有出售。 同型对照:是指与MoAb相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亚类,若使用直接免疫荧光染色法,同型对照也应标记荧光色素,如IgG1FITC、IgG2a、PE等。主要考虑了细胞的自发荧光、FC受体介导的抗体结合和非特异性抗体结合等影响因素。此外,同型对照与MoAb所标记的荧光色素、浓度、F:P比值(标记的荧光色素与免疫球蛋白分子的比值)应该相同为最佳,这对准确设定阴性与阳性细胞的界标有重要意义,切忌使用与MoAb不相匹配的同型对照,最好为同一实验室、采用相同工艺或方法制备(如同一品牌)的产品。
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生物素容易与蛋白质和核酸类等生物大分子结合,形成的生物素衍生物,不仅保持了大分子物质的原有生物活性,而且比恬度高,具多价性。此外,每个亲和素分子有四个生物素结合部位,可同时以多价形式结合生物素化的大分子衍生物和标记物。因此,BAS具有多级放大作用,使其在应用时可极大地提高检测方法的灵敏度。
特异性
亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力,其反应呈高度专一性。因此,BAS的多层次放大作用在提高灵敏度的同时,并不增加非特异性干扰。而且,BAS结合特性不会因反应试剂的高度稀释而受影响,使其在实际应用中可最大限度地降低反应试剂的非特异作用。
稳定性
亲和素结合生物素的亲和常数可为抗原-抗体反应的百万倍,二者结合形成复合物的解离常数很小,呈不可逆反应性;而且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶以及有机溶剂均不影响其结合。因此,BAS在实际应用中,产物的稳定性高,从而可降低操作误差,提高测定的精确度。
普适性
生物素-结合素系统的多功能性还能提供一套统一的研究方法。例如对于某待测分子,已经得到了对于该分子的生物素标记抗原,那么配合结合亲和素的胶体金可以在电镜下观测,配合结合荧光标记的亲和素可以使用流式细胞仪筛选,配合连接到酶的亲和素可以进行ELISA等免疫组化实验。
Eli-spot分析是设计用于在单细胞悬液中计数分泌细胞因子的细胞数量的方法。这个方法的优点在于只需在体外进行很少的处理从而使细胞因子产生的分析尽可能接近于体内状况。这个技术用于测定在给予一定刺激的情况下细胞因子产生细胞的数目,以及在某种处理或病理条件下的细胞因子产生细胞的数量。
2主要原理
细胞刺激后,原位产生的细胞因子被一种特异的单抗捕获,在细胞溶解后,捕获的细胞因子与第二种生物素化的检测性抗体结合,后者进一步通过与连接碱性磷酸酶的链亲和素结合被识别。PVDF包被孔的板之后与BCIP/NBT底物作用,紫色的斑点提示单个细胞产生的细胞因子。
35×96孔试剂盒的内容物
▲捕获抗体(0.52ml),置于4℃。
▲生物素化检测抗体(冻干,重悬于0.55ml水中)。
▲抗生物素蛋白链霉素-碱性磷酸酶结合物,置于4℃。
▲牛血清白蛋白(1g),置于4℃。
▲撇去的干牛奶(1g),放于室温。
▲备用底物溶液(50ml),置于4℃。
▲96孔PVDF包被板。
▲96孔PVDF-包被板
▲细胞培养基
▲CO2孵箱
▲70%乙醇
▲Tween20
▲碱性磷酸盐缓冲液
5直接或间接Eli-spot
细胞可以在抗体包被孔中直接刺激(直接)或者首先在24孔板或细颈瓶中刺激,收获,然后种于包被孔中(间接)。
方法根据:1)被分析的细胞类型;2)预期的细胞密度。如果细胞因子产生细胞的数量很少,建议用直接法实验,但是如果细胞因子产生细胞的数量很多,最好用间接的方法。无论采用直接或间接的方法,所有刺激以后的步骤是相同的。
主要步骤:
1)96孔PVDF板首先以70%乙醇处理,然后以捕获抗体包被。
2)将细胞放入抗体包被过的含有抗原/丝裂原的微孔中,在间接法中细胞被预刺激。
3)细胞用倒置平板法去除,与生物素标记的抗体共育。
4)与结合于碱性磷酸盐的链霉亲和素反应。
5)BCIP/NTB斑点形成。
◆刺激步骤:
小鼠脾细胞在PMA和lonomycin刺激下产生IFN-γ。人的IFN-γ由PBMC在PMA和lonomycin的刺激下产生。
建议步骤:
小鼠1)分离脾细胞,ficoll。间期收获细胞。用PBS洗三次,去除ficoll。2)用培养基稀释细胞(RPMI1640含2mML_glutamine,10%灭活的胎牛血清)含1ng/mlPMA和500ng/mlionomycin(Sigma),加2×10(4)—5×10(4)细胞到抗体包被的PVDF包被板,在孵箱中培养10—15小时。对于其它刺激物孵育时间可能不同,根据细胞因子产生细胞的密度,优化条件。
人用培养基稀释细胞(RPMI1640含2mML_glutamine,10%灭活的胎牛血清)含1ng/mlPMA和500ng/mlionomycin(Sigma),加2×10(4)—5×10(4)细胞到抗体包被的PVDF包被板,在孵箱中培养10—15小时。对于其它刺激物孵育时间可能不同,根据细胞因子产生细胞的密度,优化条件。
●试剂准备
●检测抗体用0.55ml蒸馏水溶解冻干抗体,轻轻混匀溶液并等到所有冻干抗体溶解。
●抗生物素蛋白链霉素-碱性磷酸酶用含1%BSA的PBS稀释(1/1000)
●碱性磷酸盐缓冲液(10×浓缩液)
1L溶液:80gNaCL;2gKH2PO4;14.4gNa2HPO42H2O;2gKCL,加蒸馏水至1升。检查PH在7.2-7.4之间,此溶液在用之前稀释为1×溶液。
●含2%脱脂干奶粉的PBS一块板溶0.2g干粉于10ml1×PBS。
●含1%BSA的PBS一块板溶0.2g干粉于20ml1×PBS。
●含0.1%Tween的PBS一块板溶100μlTween20于100ml1×PBS。
●70%乙醇一块板以3ml蒸馏水和7ml乙醇混匀。
★试剂保存
1)如果短时间内不用,溶解的检测抗体应分装和保存于—20℃,在这种条件下,试剂可稳定保存至少一年。
2)底物缓冲液保存于4℃。
3)链霉亲和素-碱性磷酸酶保存于4℃。
Eli-spot步骤
1PVDF包被板用100ul70%乙醇室温下处理10分钟。
2倒空孔并以100ulPBS洗3次。
3将100ul捕获抗体加到10mlPBS中,混合并分至每孔中100ul,盖上板盖,放至4℃过夜。
4倒空每孔,用100ulPBS洗一次。
5每孔加100ul含2%脱脂干牛奶的PBS,盖板,室温2小时。
6在洗涤槽上轻弹板子倒空液体,并在吸水纸上吸干。
7用PBS洗一次。
8分配每孔100ul细胞悬液(含合适的细胞数和合适的刺激物浓度),细胞可以在体外预刺激(间接Eli-spot)。盖上板,放细胞于37℃CO2孵箱,合适的时间15-20小时。(在此期间不要摇动或平移平板。)
9在洗涤槽上轻弹板子倒空液体,并在吸水纸上吸干。
10每孔加100ul含0.1%Tween20的PBS,4℃放置10分钟。
11用含0.1%Tween20的PBS洗板三次。
12每一块板,稀释100ul检测抗体到10ml含1%BSA的PBS中,每孔加100ul,封闭扳子放于37℃1小时30分钟。
13倒空扳子并用含0.1%Tween20的PBS洗三次。
14每一块板,稀释10ul链霉亲和素-碱性磷酸酶复合物到10ml含1%BSA的PBS中,每孔加100ul,封闭扳子放于37℃1小时。
15倒空,用含0.1%Tween20的PBS洗三遍,反复用吸水纸吸以去尽所有残存的液体。
16每孔加100ul备用BCIP/NBT溶液。
17让反应在室温进行5-20分钟。肉眼可见小斑点形成。
18用蒸馏水洗三次。
19干燥每孔。计数斑点。注意斑点在4℃过夜后可能会变得明显,放置扳子于室温,避免直接光照。
yyj5028
生物素和亲和素的结合部位是咪唑酮环
已修改~
下面开始更新2016的
BAS-ELISA是在常规ELISA原理的基础上,结合生物素(B)与亲和素(A)间的高度放大作用,而建立的一种检测系统。生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合。这样,结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应,既起到了多级放大作用,又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色,达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。
BAS用于检测的基本方法可分为三大类。
第一类是标记亲和素连接生物化大分子反应体系,称BA法,或标记亲和素生物素法(LAB)。
第二类以亲和素两端分别连接生物素化大分子反应体系和标记生物素,称为桥联亲和素-生物素法(BRAB)。
第三类是将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素-生物素-过氧化物酶复合物,再与生物素化的抗抗体接触时,将抗原-抗体反应体系与ABC标记体系连成一体,称为ABC法。这一方法可以将微量抗原的信号放大成千上万倍,以便于检测。 亲和层析是将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中,当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时,与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附,直接流出,从而与被分离的蛋白质分开,然后选用适当的洗脱液, 改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来。
生物素-亲和素系统可以与亲和层析的方法结合,大大提高纯化蛋白质的纯度,或者为已知配体寻找受体。步骤是首先将生物素共价结合到配体蛋白上,再将生物素化后的配体蛋白加入含有受体蛋白的混合物,然后将此混合物通过预先固定了亲和素的层析柱,这时配体受体复合物就通过生物素-亲和素系统停留在层析柱上,最后通过选择性洗脱获得此受体配体蛋白复合物或者仅有受体。这一方法被广泛运用于药物研发行业,当人们发现某种药物分子具有疗效但是又不清楚它具体作用于哪种蛋白质时,可以将其生物素化然后把靶蛋白从成千上万种蛋白质中“抓”出来。
生物素-亲和素系统还可以用相似的方法分离DNA.方法是在DNA探针的一端挂上生物素,然后用其获得目的DNA片段,再利用固定化的亲和素回收这些DNA。
传统的基因探针是由带放射性的磷酸碱基合成的,我们可以用被生物素标记的磷酸碱基合成基因探针,避免了实验过程中放射性物质可能造成的伤害。
1.avidin
英 ['ævɪdɪn]美 ['ævədɪn]
n. [生化] 抗生物素蛋白;[生化] 卵白素;亲和素
2.streptavidin
[s,trep'tævidin]
n. 链霉亲和素;抗生蛋白链菌素
亲和素(avidin,AV)亦称抗生物素蛋白、卵白素,是从卵白蛋白中提取的一种由4个相同亚基组成的碱性糖蛋白,分子量为68kD,等电点pI=10.5;耐热并耐受多种蛋白水解酶的作用.尤其是与生物素结合后,稳定性更好。生物素与亲和素间的作用是目前已知强度最高的非共价作用,亲和常数(K)为1015mol/L,比抗原与抗体间的亲和力(K=10.5~11L/mol)至少高1万倍。并且,二者的结合稳定性好专一性强,不受试剂浓度,PH环境,抑或蛋白变性剂等有机溶剂影响。由于每个亲和素能结合4个分子的生物素,这一特点可以用于构建一个多层次信号放大系统。因此,BAS即可用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测及定位观察研究,亦可制成亲和介质用于上述各类反应体系中反应物的分离、纯化。
亲和素由于带有一个糖链侧链,导致容易和细胞表面的多糖发生非特异性亲和。因此,链霉亲和素被开发出来。
链霉亲和素(streptavidin,SA)是由链霉菌streptomyces avidinii分泌的一种蛋白质,分子量为65kD。链霉亲和素分子由4条相同的肽链组成,其中每条肽链都能结合一个生物素,并且不带任何糖基,因此与亲和素一样,一个链霉亲和素分子也能结合4个生物素分子,二者亲和常数(K)亦为1015mol/L。链霉亲和素的适用范围比亲和素更为广泛。向左转|向右转

