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Encapsula/Immunodox®-Carboxylic Acid (PEGylated)/IMD-1002-

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Encapsula/Immunodox®-Carboxylic Acid (PEGylated)/IMD-1002-

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Description

Numeroustechniqueshavebeendevelopedtoprepareimmunoliposomesbasedonthenucleophilicreactivityoffreeaminegroupsofproteinsorpeptides.OneofthemostpopularandcommonlyusedmethodsistocovalentlycouplefreecarboxylicgroupstoprimaryaminesthroughactivationofthecarboxylgroupswithEDC(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide).EDC,whichisaso-calledzero-lengthcrosslinkingagent,reactswiththecarboxyltoformanaminereactiveintermediate(O-acylisourea).TheproducedO-acylisoureacanbeeasilydisplacedbynucleophilicattackfromtheprimaryaminogroupsinthereactionmixture.However,thisintermediateisunstableandhydrolyzedinaqueoussolutions.Inordertopreventtheintermediatehydrolysis,sulfo-NHS(N-hydroxysulfosuccinimide)isaddedtoEDCtoproduceasignificantlymorestableandmoresolubleactiveintermediate(NHSester).

Consequently,theimmunoliposomesarepreparedbyatwo-stepcouplingprocedure:first,activatingthefreecarboxylgroupofthelinkerlipidincorporatedintheliposomeswithEDCandsulfo-NHS,andthencovalentlyconjugatingtheantibodiestothelipidsthroughdisplacementofsulfo-NHSgroupsbyantibodyamines,asdepictedbelow.EDC/sulfo-NHScouplingreactionsarehighlyselectiveandhighlyefficient,andtheBIOLOGicalactivityoftheproteinorpeptideispreserved.

ConjugationreactionbetweenN-terminusofantibodyandcarboxylgroup-containingdoxorubicinliposome.

Immunodox®-CarboxylicAcidisaPEGylatedproduct.Forotheraminereactive(PEGylatedandnon-PEGyalatedproducts)andalsoImmunodox®productssuitableforothertypesconjugationmethodsseehere.

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FormulationInformation

Immunodox®-CarboxylicAcid(PEGylated)

LipidComposition	Concentration(mg/ml)	Concentration(mM)	MolarRatioPercentage
Total	15.89mg/ml	21.58mM	100
HydrogenatedSoyPC	9.58	12.22	57
Cholesterol	3.19	8.25	38
DSPE-PEG(2000)	2.5	0.89	4
DSPE-PEG(2000)-CarboxylicAcid	0.62	0.22	1

Buffer,LiposomeSizeandEncapsulatedDrugConcentration	Specification
Buffer	PhosphateBufferedSaline
pH	6*
LiposomeSize	100nm
EncapsulatedDoxorubicin	2mg/ml(3.45mM)
*InordertohavehighlyefficientactivationreactionwithEDCandSulfo-NHS,pHofPBSbufferwasadjustedto6.

ConjugationProtocol

MaterialsandEquipment

Inordertoconjugatetheamineonyourantibody, proteinorpeptidetoImmunodox®-CarboxylicAcid(PEGylated)liposomesyouwillneed:

EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride).Thesolutionshouldbemadefreshmomentsbeforeuse.
Sulfo-NHS(N-hydroxysulfosuccinimide).Thesolutionshouldbemadefreshmomentsbeforeuse.
Sephadex®spincolumn.SephadexsizeexclusionspincolumncanbeusedforseparationofliposomesformfreeEDC(MW:191.70).SinceEDCisbeingseparatedfromlargeliposomeparticlesthenanysizesofSephadex®spincolumnsuchasG-10,G-15,G-25,G50canbeused.However,keepinmindthatyouwilllosealargepercentageofyourliposomesonthespincolumn.Alternatively,insteadofremovingtheEDCbyspincolumnyoucanquenchitbyusing2-mercaptoethanol.
2-Mercaptoethanol.ToquenchtheunreactedEDC,2-mercaptoethanolisaddedtoformastablecomplexwiththeremainingcarbodiimide.The2-mercaptoethanolmightnotbenecessaryifyouprefertocleanupyourliposomefromfreeEDCusingaspincolumn.
Float-A-Lyzer®withaproperMWCOthateasilyallowsthecleanupofyourliposomeconjugatedligandfromfreeandnon-conjugatedprotein,peptideorantibody.YouneedtomakesurethattheMWCOisbelow1,000,000dalton.At1,000,000dalton,theporesizeonthedialysismembranegetscloseto100nmandthereforeyourliposomescanbedialyzedout.Youcannotusedialysiscassettesblindly.Pleaseunderstandthetechniquebeforeusingeitherspincolumnordialysiscassette.IfyoudonotusethecorrectMWCO,youcanloseyourentireprep.Forthisprotocol,werecommendMWCOof300,000dalton.

PreparationMethod

Thetwo-stepprotocolincludestheactivationofcarboxylgroup-containingliposomeswithEDC/sulfo-NHS,andsubsequentconjugationwiththeaminegroupontheproteins,peptidesorantibodies:

Inordertoactivatethecarboxylgroupsontheliposomes,EDCandsulfo-NHSshouldbeaddedtotheliposomes.ThetotallipidconcentrationinImmunodox®-CarboxylicAcid(PEGylated)is22.45mM.1%molofthelipidinliposomescontainsPEG-COOHgroupandonlyhalfofthemareexposedtotheoutsideoftheliposomes,whichisequalto0.11mMofreactiveconjugablelipid.For2mlvolumeliposomethisisequalto2.20×10^-7 mol,andfor5mlvolumeliposome,thisisequalto5.50×10^-7 molofPEG-COOH.Add10-foldmolarexcessofEDCand25-foldmolarexcessofsulfo-NHStoImmunodox®-CarboxylicAcid(PEGylated).Toaidinaliquotingthecorrectamountofthesereagents,theymaybequicklydissolvedinthePBSbufferatahigherconcentration,andthenapropervolumeimmediatelyPipettedintotheproteinsolutiontoobtainthepropermolarquantities. Mixwellandallowthereactiontoproceedfor15minatroomtemperature.
Beforeaddingtheprotein,peptideorantibody,removetheexcessEDCeitherusingasizeexclusionspincolumn,suchas Sephadex®spincolumn orthroughquenchingby2-mercaptoethanolata20mMfinalconcentration.Additionof2-mercaptoethanolwillnotimpacttheliposomes.
Dissolvetheprotein,peptideorantibodyat1-10mg/ml,dependingontheantibody,proteinorpeptide,inPBSorotheramine-free,carboxylatefreebuffer,pH7-8.
Addtheprotein,peptideorantibodytotheEDC/Sulfo-NHSactivatedImmundox®-CarboxylicAcid(PEGylated)liposomes.Themolarratioofthereactivecarboxyllipidtoprotein,peptideorantibodyispreferedtobearound10:1.Thetotallipidconcentrationinourliposomesis22.45mM.1%molofthelipidinliposomescontainsPEG-COOHgroupandonlyhalfofthemareexposedtotheoutsideoftheliposomes,whichisequalto0.11mMofreactiveconjugablelipid.Fora2mlvolumeliposomethisisequalto2.20×10^-7 molandfor5mlvolumeliposomesthisisequalof5.50×10^-7 molofPEG-COOH.Youwillneedtocalculatethetotalmolofyourpeptide,proteinorligandinyoursolutionandadd1:10molarratioofligandtolipid. Mixwellandallowtoreactfor2hatroomtemperature.
Removethenon-conjugatedprotein,peptideorantibodyfromtheimmunoliposomesbydialysis.Wepreferdialysistosizeexclusioncolumns.Dialysisisamuchslowerprocessbuttherewillbeminimumlossofimmunoliposomesaftertheprepiscleanedfromnon-conjugatedprotein/peptide/ligand.Spincolumnsaremuchfaster;however,youcaneasilyloseover50%oftheliposomesonthespincolumn.Werecommendusing Float-A-Lyzer® dialysiscassettefromSpectrumLabs.YouwillneedtochooseacassettewithproperMWCOdependingontheMWofyourprotein,peptide,antibodyorantibodyfragment. NOTE: Ifyoudecidetouseadialysiscassette,youwillneedtomakesurethattheMWCOisbelow1,000,000dalton.At1,000,000dalton,theporesizeonthedialysismembranegetscloseto100nmandtherefore,yourliposomescanbedialyzedout.Youcannotusedialysiscassettesandspincolumnsblindly.Theycomeinvarioussizesandyouneedtochoosethecorrectsizewisely.Dialyzetheimmunoliposomesolutionin1literofPBSatpH7.4for8hours.Changethedialysisbufferwithafresh1literofPBSandletisdialyzeforanother8hours.Afterthisstep,yourcleanedupimmunoliposomeisreadytobeused.

LiposomeParticleCalculator

Immunodox®liposomesareunilamellarandsizedto100nm.Themolarconcentrationofliposomeis21.58mM.Byhaving liposomediameter(nm)andlipidconcentration(µM),youcancalculatethetotalnumberofthelipidsinoneliposomeandthenumberoftheliposomesinonemilliliteroftheliposomesolution.Tousethecalculatorclick here.

TechnicalNotes

Doxorubicinisafluorescentmoleculewithλ_ex470nmandλ_em585nm.Ifyouareusingafluorescenttagonyourantibodyorligand,youneedtomakesurethattheywillnotinterferewitheachother.
EDCandsulfo-NHSshouldbepreparedimmediatelybeforeuseandkeptatroomtemperature.
TheactivationreactionwithEDCandSulfo-NHSismostefficientatpH4.5-7.2,andEDCreactionsareoftenperformedinatpH4.7-6.0.Forthisreason,wehaveformulatedtheliposomesinPBSbufferandadjustedthepHto6.
ReactionofSulfo-NHS-activatedmoleculeswithprimaryaminesismostefficientatpH7-8,andSulfo-NHS-esterreactionsareusuallyperformedinphosphate-bufferedsaline(PBS)atpH7.2-7.5.
Trisbuffershouldneverbeusedinanystepoftheprocesssinceitcontainsamine.
IfyouareusingaligandorpeptidethatishydrophobicthenitisrecommendedtosolubilizeitinDMSOorDMFandthenaddthebuffertoit.Itisrecommendednottousemorethan5%volumeofDMSOorDMFinthesolution.DMFandDMSOarebothcompatIBLewithliposomesandtheyarealsomiscibleinwater.Otherorganicsolventsuchasethanolandchloroformarenotcompatiblewithliposomesandwillcausetheliposomestolyse.IfyouendupusingDMSOorDMFthenaftertheconjugationreactionisdone,youneedtoremoveDMSOandDMFfromtheliposomes.InordertodothatyouneedtouseadialysiscassettethatismadefromREGENERATEDCELLULOSEMEMBRANE.NOTE:NotallmembranesarecompatiblewithDMFandDMSO.WerecommendusingaSlide-A-Lyzer™MINIDialysisDevicewithMWCOof2KmadefromregeneratedcellulosemembranemanufacturedbyThermofisher.AfterDMSOorDMFisremoved,youcanuseFloat-A-Lyzer®dialysisdeviceforthefinalstepofcleaninguptheprep.
Liposomesshouldbekeptat4°CandNEVERbefrozen.

Database

Directlinktothedatabasepageforeasynavigation:ImmunoliposomesConjugationDatabase

Appearance

Immunodox®-CarboxylicAcidisaredtranslucentliquidmadeofnanosizeunilamellarliposomes.Usuallyduetothesmallsizeofliposomesnosettlingwilloccurinthebottomofthevial.Theliposomesarepackagedinanambervial.

EducationalVideo

Ordering/ShippingInformation

Allliposomebasedformulationsareshippedonblueiceat4°Cininsulatedpackagesusingovernightshippingorinternationalexpressshipping.
LiposomesshouldNEVERbefrozen.Icecrystalsthatforminthelipidmembranecanrupturethemembrane,changethesizeoftheliposomesandcausetheencapsulateddrugtoleakout.Liposomesinliquidformshouldalwaysbekeptintherefrigerator.
ClientswhoorderfromoutsideoftheUnitedStatesofAmericaareresponsiblefortheirgovernmentimporttaxesandcustomspaperwork.EncapsulaNanoSciencesisNOTresponsibleforimportationfeestocountriesoutsideoftheUnitedStatesofAmerica.
WestronglyencouragetheclientsinJapan,Korea,TaiwanandChinatoorderviaadistributor.Toughcustomsclearanceregulationsinthesecountrieswillcausedelayincustomclearanceoftheseperishableformulationsifordereddirectlythroughus.Distributorscaneasilyclearthepackagesfromcustoms.Toseethelistofthedistributorsclickhere.
ClientsorderingfromuniversitiesandresearchinstitutesinAustraliashouldkeepinmindthattheliposomeformulationsaremadefromsyntheticmaterialandtheformulationsdonotrequirea“permittoimportquarantinematerial”.LiposomesareNOTbiologicalproducts.
Ifyouwouldlikeyourinstitute’sFedExorDHLaccounttobechargedforshipping,thenpleaseprovidetheaccountnumberatthetimeofordering.
EncapsulaNanoScienceshasnocontroloverdelaysduetoinclementweatherorcustomsclearancedelays.YouwillreceiveaFedExorDHLtrackingnumberonceyourorderisconfirmed.ContactFedExorDHLinadvanceandmakesurethatthepaperworkforcustomsisdoneontime. AllsubsequentshippinginquiriesshouldbedirectedtoFederalExpressorDHL.

StorageandShelfLife

Storage

Immunodox®productsshouldalwaysbestoredatinthedarkat4°C,exceptwhenbroughttoroomtemperatureforbriefperiodspriortoanimaldosing.DONOTFREEZE.IfthesUSPensionisfrozen,theencapsulateddrugcanbereleasedfromtheliposomesthuslimitingitseffectiveness.Inaddition,thesizeoftheliposomeswillalsochangeuponfreezingandthawing.

ShelfLife

Immunodox®-CarboxylicAcidismadeondailybasis.Thebatchthatisshippedismanufacturedonthesameday.Itisadvisedtousetheproductswithin4monthsofthemanufacturingdate.

ReferencesandbackgroundreADIng

1.HermansonGT.Bioconjugatetechniques.Academicpress;2013Jul25.

2.TorchilinV,WeissigV,editors.Liposomes:apracticalapproach.OxfordUniversityPress;2003Jun5.

3.GrabarekZ,GergelyJ.Zero-lengthcrosslinkingprocedurewiththeuseofactiveesters.Analyticalbiochemistry.1990Feb15;185(1):131-5.

4.YanL,CraytonSH,ThawaniJP,AmirshaghaghiA,TsourkasA,ChengZ.ApH‐ResponsiveDrug‐DeliveryPlatformBasedonGlycolChitosan–CoatedLiposomes.Small.2015Oct1;11(37):4870-4.

5. Silva-LópezEI,EdensLE,BardenAO,KellerDJ,BrozikJA.ConditionsforliposomeadsorptionandbilayerformationonBSApassivatedsolidsupports.Chemistryandphysicsoflipids.2014Oct31;183:91-9.

6.HazraM,SinghSK,andRayS.SurfaceModificationofLiposomalVaccinesbyPeptideConjugation.JournalofPharmaSciTech,2011;1(1):41-47.

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M-MLV逆转录酶是由北京鸿跃科技有限公司代理或销售的omega品牌的试剂，产品来源于美国。北京鸿跃科技有限公司是中国最权威的M-MLV逆转录酶试剂销售服务商之一，在北京等地方销售M-MLV逆转录酶试剂已经多年。生物在线为您提供众多企业M-MLV逆转录酶仪器产品及图片，以便挑选到性价比高，合适的M-MLV逆转录酶产品查看更多>

超滤机和RO净水机有什么不同?超滤净水器的工作原理净水器网

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货号：A0010 查看更多>

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求用过QIAgen plasmid Maxi Kit 试剂盒的大神,有几个问题请教一下...123

胜胜6e處D2021-08-09

qiagen有体外转录试剂盒么
转录的只是插入的片断，怎么会跟模板一样大呢，一般情况下应该比模板小多了。我都是跑电泳，严格来说应该跑变性的；嫌麻烦可以非变性，快速（防止RNA降解）十分钟即可；抛出来的带会有两条，上面大的是模板，下面一条比较亮的是RNA，那么你的转录就成功了。
PCR第一个步骤如果没记错的话应该叫“变性”， PCR的话是不需要解旋酶的，直接利用DNA的高温变性特性，在高温下，使氢键断开，DNA双链恢复为单链。（还有解旋酶好像是解除双螺旋的结构，是一种拓扑异构酶，对于氢键的打开没有贡献吧

第一链反转录试剂盒一般大家都买哪家的啊?123

4563wd2021-07-27

对于新手来说购买反转录试剂盒是比较理想的，买一个kit看看说明书操作就可以了。推荐两款kit TAKARA和HaiGene，这两款试剂盒都能对RNA样品中的gDNA有效去除，因此对RNA质量的要求不高。TAKARA的RR047A操作方便，反转录温度为37℃，对于大多数试验来讲是满足要求的。HaiGene的D0401操作要多一个步骤，但其反转录温度是55℃（耐高温的反转录酶），提高了反转录温度使得高GC含量、复杂模板、长mRNA的模板都能有效反转录，因此其反转录效率更高，更能够获得样本中基因的真实表达量。如果后续试验是RealTime PCR、ORF克隆、高GC含量、或者你的待研究基因结构复杂程度未知，还是选用耐高温的反转录酶更理想。对于反转录高手来说，直接购买反转录酶、再购买Rnase Inhibitor自己配制反转录体系就可以了。对于样本量大的课题组来讲，相对还是比较经济的。选择反转录酶时仅需要考虑是否需要耐高温的酶，来克服目的基因的复杂结构就可以了。PROMEGA、TAKARA、HaiGene、 TRANSGEN等品牌的反转录酶性价比还都是不错的。Life、NEB的也不错，不过性价比一般，不一一解释了。

【求助】小鼠逆转录可以用Thermo 的试剂盒吗核酸基因技术丁香 ...123

xiayu7909212021-08-01

近期要做小鼠的RNA纯化、逆转录，临做了才想起来小鼠可以用我们常用的试剂盒吗，ThermoScientificRevertAidHMinusFirstStrandCDNASynthesisKit,试剂盒中的引物Oligo（dT)Primer可以用于小鼠吗？

【求助】mRNA逆转录后得到的cDNA是单链还是双链核酸基因技术...123

风吹的纱2017-10-06

是单链cDNA，想合成双链cDNA需要另外操作：一、cDNA第二链的合成:1. 第一链反应完成后,取2ul一链产物－20℃冰箱中保存，待电泳检测。其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂(promega):20ul 10×DNA Polymerase I buffer6ul 10mM dNTP(自己配制)xul dd H2O1ul RNase H(2U/ul)10ul DNA Polymerase I(10U/ul)总体系为200ul;2. 混匀后,16℃反应2.5小时;3. 70℃灭活10分钟;4. 反应完成后,得到200ul cDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上;5．取2ul二链产物，同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kb ladder，确定双链的大小范围。注：一链，二链的电泳图是smear，且二链稍比一链大一些。二、双链cDNA末端补平:1. 在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega):6ul 10mM dNTP2ul T4 DNA Polymerase(8.7U/ul) 2ul BSA(10mg/ml)2. 稍微离心混匀反应物, 37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟;3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;4. 离心后,吸取上清于另一1.5ml eppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;5. 吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3M NaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;6. 第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;7.离心完毕,弃上清,加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟;8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.注：第3，第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。PCR纯化试剂盒操作流程：1．溶液PE使用前应加入适量体积95％－100％的乙醇，混匀。2．向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB，混匀。3．加入spin column中，13000rpm离心1min。4．加入0.75ml buffer PE，13000rpm离心1min。5．13000rpm，再离心1min。6．将spin column放入一新的离心管中，加入50ul buffer EB，静置10min。7．13000rpm离心2min。8．加入30ul buffer EB，静置10min。9．13000rpm离心2min。10．加入1/10体积3M的NaAc，2.5倍体积无水乙醇，混匀，－20℃沉淀过夜。

逆转录试剂盒逆转录出来的cDNA是单链还是双链核酸基因技术...123

列刖2017-10-06

氯仿/，混匀,常温下13000g离心5分钟，混匀，然后顺序加入下列试剂(promega).离心完毕.离心完毕,剧烈振荡后,加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀. 第二日,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;ul) 2ul BSA(10mg/. 吸取上清至另一eppendof管,将昨日沉淀物在4℃;10体积3M的NaAc: 1：一链，第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替，同保存的一链产物一起电泳鉴定。 6．将spin column放入一新的离心管中,取2ul一链产物－20℃冰箱中保存。 8．加入30ul buffer EB;异戊醇： 1．溶液PE使用前应加入适量体积95％－100％的乙醇. 在第二链反应体系中. 反应完成后;10V3M NaAc(PH5.5倍体积无水乙醇; 5，再离心1min是单链cDNA。 3．加入spin column中.2)和2，混匀，加入50ul buffer EB,得到200ul cDNA第二链反应体系。 2．向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB. 第一链反应完成后; 3;ml) 2,将此体系置于冰上。 PCR纯化试剂盒操作流程; 5．取2ul二链产物,然后75℃灭活10分钟：第3; 4。同时上1kb ladder、cDNA第二链的合成. 加入等体积酚/。二，想合成双链cDNA需要另外操作.5V预冷的无水乙醇: 6ul 10mM dNTP 2ul T4 DNA Polymerase(8,加入等体积氯仿. 离心后。 9．13000rpm离心2min, 37℃反应至少30分钟,干燥沉淀至无乙醇气味,弃上清. 70℃灭活10分钟. 混匀后，待电泳检测，混匀,顺序加入下列试剂(promega)，且二链稍比一链大一些. 稍微离心混匀反应物，13000rpm离心1min，确定双链的大小范围：一,常温下13000g离心5分钟,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA.5小时，静置10min，－20℃沉淀过夜: 1;ul) 总体系为200ul;ul) 10ul DNA Polymerase I(10U/.75ml buffer PE。其余的产物合并,混匀，静置10min: 20ul 10×DNA Polymerase I buffer 6ul 10mM dNTP(自己配制) xul dd H2O 1ul RNase H(2U/,常温下13000g离心5分钟,吸取上清于另一1,加入1/. 注; 8; 2; 7,弃上清,16℃反应2。注; 3。 10．加入1/。 4．加入0，2、双链cDNA末端补平.7U/ 4。 5．13000rpm,上下颠倒几次混匀后。 7．13000rpm离心2min，二链的电泳图是smear.5ml eppendof管中; 6，13000rpm离心1min

逆转录试剂盒123

苗苗8862021-07-22

我是RT-PCR新手，请问逆转录试剂盒里面有什么试剂组成的？在逆转录过程中要注意什么事项?谢谢！

...】请问各位站友,我的逆转录试剂盒室温下放了6个小时还能用吗? ...123

曳綳蚶2021-08-15

trizol法提取大小RNA，trizol买invitrogen公司的。逆转录用promega公司的M-MLV

第一链cDNA合成(逆转录)试剂盒使用说明书 123

卖萌jdqtg2017-10-06

需要，用Oligo(dT)或随机引物

Takara的逆转录试剂盒怎么样呢?和Toyobo的比起来呢? 分子生物 ...123

疯子mjLW82017-10-01

日本的。
首先，不否认它比大多数国产的试剂盒做得好，提取的纯度、方便度和量，都还很不错。
其次，它是日本的。so我觉得实验室用用天根的，就非常好了。拒绝日货，从实验室做起。