荧光定量PCR详细流程和问题解析

普通PCR与荧光定量PCR技术区别？

简单的讲PCR技术最早是用于扩增一段特异的PCR片段，用于克隆、测序等实验，后来也将其用于样本中特异的PCR片段有无或非很粗的相对定量，而荧光定量PCR技术则是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量，是一种测定特异的PCR片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA的含量等。

前些年有人讲过普通PCR后，通过电泳也可以进行定量，其实是将PCR产物的定量与PCR样本中模板定量相混了。近两年没有人再讲这类的话了。

SybrGreen、Taqman、Molecularbeacon、LUX这些方法如何选择？从实验成本来讲，SybrGreen是最好的，基本上就是普通PCR加上一点SybrGreenI荧光染料即可，其信号强度也很好，还可以进行融解曲线分析等，但缺点是只能在一个反应管内进行一种PCR反应的检测，另一个问题是非特异性扩增会影响实验结果，当然也有一些技术解决这些问题，后面会讲到。对于研究人员来讲，如果需要检测的基因很多，而每个反应管中进行一种PCR反应的检测可以满足实验要求，则SybrGreen是最好的选择。

如果需要进行多通道实验，即在一个反应管中进行2种或以上的反应，则要选择其他的方法，最常用的是Taqman、Molecularbeacon，这两种都是探针的方式，由于增加了探针的特异性，因此其扩增曲线反映的就是特异性产物的扩增曲线，不含有非特异性扩增的成分。因此商业用途的检测试剂盒大都采用这一技术，以减少非特异性产物造成错误结论的可能性。其缺点在于探针成本较高，有时设计的探针并不合适，有造成损失的可能性。并且要进行较多的实验条件的优化。这两种探针技术用于商业目的时都有专利问题，据说取得Molecularbeacon的许可权的成本相对较低，但只是据说。

另一种值得一提的是LUX探针，它也可进行多通道实验，但它没有Taqman和Molecularbeacon方法的增加探针特异性的功能，因此只能是一种折中的方案，如果不考虑多通道实验，则不如SybrGreen法

选择单通道实验还是多通道实验？

这是要根据实验需要来选择的，如果有一个、两个或是三个基因要进行比较，并用看家基因进行对照，可以考虑选择多通道实验。多通道实验的好处是可以消除样本加样的误差。但要克服的困难也比较多，一是条件的优化比较麻烦，即多种PCR反应以及探针要在同一个反应条件下进行，并且效率都要比较高，另一个困难是要求相互之间没有干扰，因为干扰会影响到实验结果。还有一个困难是当一个基因的模板数显著大于其他基因时，因为共用核苷酸等资源的原因，会让模板数少的基因的定量值变小或变为零。因此一般两通道的实验比较多些，即一个基因进行多样本比较，用看家基因进行对照。

可以看出，如果单通道实验可以解决问题，就不要选择多通道实验了。三个以上的基因进行比较时就最好用单通道。因为一般的仪器最多也只有四个通道，就是有更多的通道，实验条件的优化也是足够麻烦了。

双通道实验时如何克服反应条件、干扰以及模板数差别很大等困难？对于反应条件的优化，可通过两个单独实验的标准曲线来优化，主要是复性温度，可用PCR仪的温度梯度功能来选择，然后找到一个合适的复性温度。对于如何确定是否存在相互干扰，则要通过两个独立的单通道实验与双通道实验的结果进行比较，如果差别不大，则表明没有干扰。至于模板数差别很大的问题，可以通过降低引物浓度的方法来实现，即primerlimited，在一般的PCR反应中，引物的浓度是足够高的，基本上可以将反应液中的核苷酸全部消耗尽，在优化引物浓度时，用不同的引物浓度进行实验，找到不影响反应的C值的最低引物浓度。这样在实际反应中，模板数高的基因在引物耗尽后，反应液中仍然有足够的核苷酸等用于另一个基因的反应。

引物设计中的几个注意事项

1、引物设计最好用相关的软件来进行设计，考虑引物自身回折、错配、引物二聚体、复性温度、产物变性温度等问题，其中产物的变性温度是大家不太关心的问题，但有些产物在一般的95度条件下不能充分解链，会严重影响实验结果。2、引物所设计的片断一定要有足够的特异性，选择好片段后，最好到互联网中进行相关的搜索，看在样本的基因组有没有相拟的基因以及假基因等，如果有，则可选择特异性更高的区域。

3、在进行mRNA表达量的定量，可以在引物设计时考虑基因组的污染问题，即在引物设计时让两个引物跨一个内含子，这样基因组污染所造成的扩增可以区别出来，或因为片段过大而不能扩增

4、由于mRNA表达量的定量有一个逆转录的过程，如果逆转录是用poly（T）作引物，则设计的片段尽量靠近poly（A），以免逆转录的效率影响到实验结果。如果用特异性引物进行逆转录，则要考虑引物区是否存在RNA二级结构的问题5、产物片段的大小：定量PCR一般产生片段都不大，不会超过600bp。SybrGreen法一般选择250-600bp，过大会影响到PCR扩增的效率，过小则很难通过融解曲线与引物二聚体分开，但并不是绝对的。Taqman法的扩增片段都很小，几十或是100多，这是其原理造成的。Molecularbeacon法对片段大小的要求不高，只要不是太长即可。

SybrGreen法的实验策略：

实验可分为三个阶段，即实验条件的优化、预实验和正式实验。一、实验条件的优化阶段，这一阶段是最花时间的，

1、要找到一个阳性的模板，可以是克隆有基因质粒、强阳性样本或纯化的PCR产物等。有了阳性的模板才能进行最基本的定量扩增实验，如果有普通PCR的实验条件，也可以此为基础进行实验。

2、扩增出的产物要通过电泳方法确定其大小，以确认定量PCR扩增的产物是你的目的基因，有些用户就发生过优化了几天的条件才发现扩增片段的大小不对，不是自己想要的基因。当然，能测个序什么的最好。并通过融解曲线实验来确定产生的Tm值以及所用的变性温度是否已经足够，个别情况下会出来解键不充分的现象。

3、有了基本的PCR条件后，要将阳性模板进行倍比稀释，一般用10倍稀释。将稀释的模板带上阴性对照，分成多份进行温度梯度实验，对复性温度进行优化，以找出复性温度范围，复性温度最好能满足以下条件：高中低模板浓度下PCR扩增效率都很高、阴性模板没有扩增。选择满足条件的中间温度，这样可以提高实验的稳定性，不会因为样本管在加热模块中的位置不同而影响实验结果。

4、如果找不到合适的条件，如引物二聚体过多，可对引物浓度、Mg2+离子浓度、DMSO含量等进行优化，然后再进行复性温度梯度实验。其中Mg2+离子浓度、DMSO含量都会影响Tm值以及所用的变性温度。

二、预实验阶段

按照优化的条件对所需要分析的样本做一个没有重复的实验，每个样本做一个10倍和100倍稀释的实验，预实验的目的主要有两个，一是了解样本的模板浓度范围，如果有样本的模板浓度在标准曲线之外，如过高或过低，则可能要对标准曲线进行重新优化，当然，如果过高和过低不影响你的实验结论则可定为高于多少或低于多少，直接进行外推是不科学的。另一个目的看样本中是否有PCR抑制物的影响，如果每个样本的定量结果与其10及100倍稀释后的样本的结果相同，则表明没有抑制物的影响，如果不同，如原倍结果为零，而10及100倍稀释后的样本的结果为阳性，则表明样本中PCR抑制物浓度较高。可用其10及100倍稀释后的样本进行定量。

有几个用户发现过实验为阴性的样本在其10及100倍稀释后的样本为阳性的，也许有更多用户没有进行这样的实验，得到了错误的结论。因为样本RNA的提取试剂中经常有抑制PCR反应的物质，清洗不干净就会影响到定量PCR反应。

三、正式实验阶段

然后就可以进行正式实验了，只需要将每个样本作三个或更多的重复即可以了。有抑制物的样本先进行稀释，计算浓度时不要忘记就行了。最后就可以进行实验结果分析了，个别样本中离群的数值可以删除。

SybrGreen法的注意事项

1、最好按照上面提到策略进行实验，以免造成不必要重复实验，从而降低实验成本

2、SybrGreenI一般是先将母液用DMSO进行稀释100倍，最终的使用浓度为4000-10000分之一。可能不同的SybrGreenI母液的稀释倍数不同，可通过实验来证明，但高浓度的SybrGreenI肯定会影响PCR反应。另外用水稀释后的SybrGreenI保存的时间很短，一般1周后就不能用了。DMSO似乎反复冻融会影响性能，但原因不明。3、在对引物浓度、Mg2+离子浓度、DMSO含量等进行优化后仍得不到满意的结果，特别是引物二聚体很多时，可以考虑更换引物，因为引物成本低，而优化实验成本很高。

4、当有少量引物二聚体影响荧光结果时，可以提高荧光读板时的温度来消除引物二聚体的影响，如将读板时的温度提高到82度，此时引物二聚体已经解链而产物没有解链。但引物二聚体浓度很高时会严重影响PCR反应，消除引物二聚体的影响也没有用。有荧光定量PCR扩增的效率都接近于100%，可以通过实验来证明。但大多数用户并没有进行这样的实验就直接用2ΔΔC（t）来计算了。这是错误的，会得到错误结论。

6、无论是使用自配的试剂还是用商业的荧光定量试剂盒，最好买够试剂，以免进行预实验或正式实验时没有试剂而必需采用其他试剂，由于不同试剂的缓冲液成份有较大差别，如有的试剂中含有DMSO及Mg2+离子等，可能会影响到实验结果，甚至要重新进行实验条件的优化。

7、不要在管盖上写字，原因很明显，但有些用户习惯了写字，后来再擦掉，也会对实验有些影响。

8、最好使用高质量的PCR管，低质量管的管间差可能会很大。

9、每次实验一定要有阳性对照和阴性对照，以免出现问题时找不到原因。10、在样本很珍贵时可以采用对样本进行稀释的方式进行定量。只要浓度不是太低，理论来讲对稀释是不会影响实验结果的。

其他方法也可以采用类拟的策略，以节约成本，提高效率。

想到的内容就这些了，希望大家多批评指正。

5、大家都知道进行绝对定量需要标准曲线，有些用户认为进行相对定量