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Dharmacon的CRISPR-Cas9基因编辑应用
什么是CRISPR-Cas技术？
基于天然存在的细菌和古细菌免疫系统，短RNA可用于以高特异性将核酸酶蛋白引导至复杂的真核生物基因组内的靶标。这些系统广为人知，称为CRISPR-Cas（聚簇有规律地穿插的短回文重复序列）技术，它依赖于CRISPR相关的（Cas）蛋白，具有执行基因组编辑功能或改变基因表达的潜力。CRISPR-Cas9基因组编辑系统的组件可以多种方式组合在一起，用于各种基因编辑应用。
CRISPR-Cas系统可能有哪些应用？
基因沉默
所述Cas9核酸内切酶 已成为用于定向基因在真核系统[1-3]编辑的流行工具。通过使用靶标特异性CRISPR RNA（crRNA）和反式激活crRNA（tracrRNA）或称为单向导RNA（sgRNA）的融合形式），Cas9核酸内切酶可将复杂哺乳动物基因组中的位置作为双链断裂[1]。这些断裂可以通过内源性DNA修复机制通过统称为非同源末端连接（NHEJ）的过程进行修复。由于NHEJ容易出错，因此可能会导致基因组缺失或插入（indels），从而产生移码和过早终止以永久沉默靶基因。重要的是要意识到，NHEJ产生的插入和缺失是随机的，并且在每个细胞之间都不同。可以通过在克隆细胞系上进行其他实验来确定产生的确切基因组变化。crRNA，tracrRNA和sgRNA可以在体外细胞内转录转录或定制合成，并通过转染引入。Cas9核酸内切酶的细胞内表达可以通过由组成型或诱导型启动子驱动的质粒或整合的慢病毒表达载体来完成。有效水平的细胞内Cas9也可以通过不含DNA的系统进行传递，该系统的优势是通过转染编码Cas9或Cas9蛋白的mRNA来极低地进行其他基因组改变。
无DNA的CRISPR-Cas9基因编辑
“无DNA”的CRISPR-Cas9基因编辑的真正含义是什么？这意味着您的系统不使用DNA载体形式的CRISPR-Cas9组件。每个成分都是RNA或蛋白质。从Cas9 mRNA 或纯化的Cas9蛋白开始 作为基因组工程实验中Cas9核酸酶表达的来源，在某些应用中具有优势。为什么？基于DNA的Cas9或指导RNA表达系统的使用可能会由于切割位点上的质粒DNA整合或慢病毒载体随机整合而带来不良的遗传改变。因此，无DNA基因编辑系统可能是创建工程化细胞系的好选择。如果您的实验涉及观察非克隆细胞群中的表型，则可能不需要无DNA的选项。但是，如果您的实验最终目标不需要富集Cas9表达细胞，并且希望避免潜在的整合事件，请考虑使用Cas9 mRNA或纯化的Cas9蛋白。
同源指导修复（HDR）
CRISPR-Cas9诱导的双链断裂也可以用作创建敲入而不是靶基因敲除的机会。供体模板的精确插入可以改变基因的编码区，以“固定”突变，引入蛋白质标签或创建新的限制性位点。我们已经证明，单链DNA可用于使用带有Cas9核酸酶的合成crRNA和tracrRNA产生精确的插入。或者，可以将Cas9的活性改变为切口，而不是进行双链切割。Cas9切口酶可与一对crRNA：tracrRNA复合物或sgRNA一起使用，这些复合物或sgRNA靶向相反链上两个紧密间隔的区域，当与短双链DNA一起使用时，可进行同源性定向修复[2，4]。
瞬时基因沉默或转录抑制（CRISPRi）
在此应用中，Cas9进行了修饰，使其无法切割DNA，并且与靶向启动子区域的引导RNA结合时，复合物可降低转录活性和伴随的基因表达[5，6]。
内源基因（CRISPRa或CRISPRon）的瞬时激活
通过使用不能切割DNA且已融合转录激活域的Cas9突变体，可以通过将Cas9融合蛋白靶向内源靶基因或多个基因的启动子区域来上调内源基因的表达。 [6，7]。
胚胎干细胞和转基因动物
CRISPR-Cas系统可用于快速高效地改造鼠类胚胎干细胞的一种或多种遗传变化，以产生转基因小鼠[8]。相似的方法已被用于遗传修饰灵长类动物单细胞胚胎[9]。
合并基因组规模的基因敲除筛选
汇集的慢病毒文库已以较低的MOI进行了癌细胞生存力，多能性和耐药性的基因组规模筛选[10，11]。通过单拷贝数整合，可以高频率实现双等位基因沉默。可以通过下一代测序鉴定参与产生筛选表型标准的基因的相对表达（例如细胞死亡，增殖，耐药性等）。
CRISPR-Cas9控件在实验设计中的重要性
阳性对照
对于几乎所有的CRISPR-Cas9基因编辑应用，使用一个或多个阳性对照都是必不可少的第一步。转染效率因细胞类型而异，必须针对每种类型进行优化以实现高效基因编辑。已知可以高效编辑和/或靶向基因敏感区域以实现清晰表型读数的指导RNA，应用作阳性对照。阳性对照实验的结果应通过错配检测分析进行评估，以确认插入缺失的存在，并针对每种评估的转染条件量化编辑效率。一旦确定了最佳条件，就可以使用由阳性对照确定的相同高效条件开始进行实验基因编辑。
负面控制
阴性对照对于旨在通过表型读数评估的CRISPR-Cas9实验尤其重要。用阴性对照处理的细胞中细胞表型，活力或基因表达水平的变化可能反映了基线细胞反应，可以将其与用靶标特异性crRNAs处理的细胞水平进行比较，以更准确地解释结果。
用于CRISPR-Cas9实验的合成sgRNA
尽管天然合成的两个RNA（crRNA：tracrRNA）系统在大多数应用中非常有效且具有成本效益，但是研究体内和离体模型的研究人员已表明更喜欢sgRNA系统。
CRISPR-Cas9指导RNA功能
为了确定选择最佳功能指导RNA的标准，我们开发了一种基于功能基因敲除的算法，该算法使用具有GFP读数的蛋白酶体功能的表型分析。概述如何使用Edit-R算法来选择更可能导致功能性蛋白质敲除的指导RNA。
CRISPR-Cas9指导RNA特异性
鉴定潜在的脱靶裂解位点对于CRISPR特异性至关重要。详细了解 可用的对齐工具和策略。
诱导型慢病毒Cas9核酸酶
任何基因编辑实验的时机都是至关重要的，尤其是在建立集合屏幕，产生稳定的细胞系而没有增加代谢负荷的风险或将Cas9整合到前体状态并在后来的细胞状态下进行实验时。一个可诱导的慢病毒核酸酶Cas9 可以提供必要的，以确保仅在需要时编辑发生的时间控制。
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