生物素标记五聚体 - ProImmune - 掌握免疫 _ MHC 五聚体、CD1d 四聚体、定制肽合成、免疫测定、T 细胞表位发现、HLA 组织分型、细胞分析、配体结合测定、免疫应答
生物素标记的 Pro5® MHC I 类五聚体可用于计数和分离抗原特异性 CD8+ T 淋巴细胞。多聚体 MHC-肽复合物与特定特异性的 T 细胞受体 (TCR) 结合，具体特异性由 MHC 等位基因和肽组合决定。 CD8+ T 细胞用生物素标记的 Pro5® 五聚体染色，然后用荧光链霉亲和素缀合物染色，可通过流式细胞术进行分析，以确定抗原特异性 T 细胞的频率。
生物素标记的五聚体还可以通过使用链霉亲和素包被的磁微珠来分离或消除抗原特异性 CD8+ T 细胞。如果需要获得活细胞用于进一步分析（例如 T 细胞培养或基因表达谱），则以这种方式分离抗原特异性 T 细胞是有用的。生物素标记的五聚体也可用于基于平板的测定，例如s ELISA，可将它们固定在链霉亲和素包被的表面上。
Pro5® Biotag 是一种生物素标记蛋白，可与未标记的 Pro5® 五聚体特异性结合，作为辅助试剂用于流式细胞术分析。使用五聚体加 Pro5 Biotag 与所选荧光标记的链霉亲和素缀合物结合染色的 CD8+ T 细胞可以通过流式细胞术进行分析，并确定抗原特异性 T 细胞的频率。因此，使用带有未标记五聚体的 Biotag 可以提高实验灵活性并增强五聚体染色的应用能力。
应用：流式细胞术结合生物素标记五聚体对 CD8+ T 细胞进行染色可以通过流式细胞术分析所选的荧光标记链霉亲和素缀合物，以确定抗原特异性 T 细胞的频率。多种链霉亲和素缀合荧光染料可与生物素标记的五聚体一起使用，从而提高sed 在多通道流式细胞仪染色实验中的灵活性。
下图显示了使用 B*08:01/RAKFKQLL (EBV BZLF-1) 对 1 x 106 外周血细胞进行染色的示例染色-特定生物素标记的五聚体，后接 SA-PE、SA-PerCP 或 SA-PE Cy5。尽管每个荧光标记的荧光强度不同，但仍能实现相似程度的抗原特异性染色。
使用生物素标记的五聚体与链霉亲和素 c 结合使用，可以轻松分离或消除抗原特异性 CD8+ T 细胞镀膜顺磁珠。 ProImmune 的生物素标记五聚体适用于任何微珠系统和微珠供应商，这意味着它们可以与现有试剂和设备一起使用。如果需要获得活细胞用于进一步培养或分析（例如表达谱分析），则以这种方式分离抗原特异性 T 细胞是有用的。
下图显示了外周血中抗原特异性细胞的消耗。使用 B*08:01/RAKFKQLL (EBV BZLF-1) 特异性生物素标记五聚体制备血液悬浮液。将原始细胞群样品（去除前）和分离后的上清液（去除后）与抗 CD8-FITC 抗体加 SA-PE 一起孵育，以可视化抗原特异性细胞。抗原特异性群体从 1.53% 减少至 0.04%，证实 EBV BZLF-1 细胞的微珠分离成功。
人工抗原呈递已成为刺激和扩增培养细胞的重要工具。生物素标记的五聚体可以与 >2μm 链霉亲和素标记的顺磁珠偶联，并与共刺激抗体，例如生物素化抗 CD28 和抗 CD40 抗体，可在体外刺激单一抗原特异性 T 细胞。
应用：免疫测定生物素标记的五聚体可可以固定在任何链霉亲和素包被的表面上，用于体外测定，例如基于板的 ELISA。五聚体特别适合该实验平台，因为摩尔的延伸定向结构cule 意味着高拷贝数的 MHC 分子被呈现/可用。
在下图中，96 孔 ELISA 板涂有 A*02:01 特异性生物素的连续稀释液 -标记为五聚体。通过添加抗 A*02:01 构象抗体，然后添加抗小鼠 Ig-HRP 和 TMB（3,3\',5,5\' - 四甲基联苯胺）来可视化结合的五聚体。在 450 nm 处读取平板，绘图显示五聚体浓度与吸光度的关系。
生物素化 Pro5® MHC I 类五聚体的 ELISA 固定![\"\"](\"https://www.proimmune.com/wp-content/uploads/2018/08/fab2_elisa.jpg\")
洗涤缓冲液（0.1% 叠氮化钠、0.1% BSA 的 PBS 溶液）、固定溶液（1% 胎牛血清、2.5% 甲醛的 PBS 溶液）、生物素标记的 Pro5 ® 对所选抗原具有特异性的五聚体、荧光标记的链霉亲和素缀合物、抗 CD8 抗体（与链霉亲和素缀合物具有不同的荧光）。
每个染色条件分配 1-2 x 106 个淋巴细胞（PBMC 或脾细胞）。 （由于抗原特异性 T 细胞的频率较高，因此在使用 T 细胞克隆或细胞系时，每种染色条件仅分配 2-5 x 105 个细胞）。用洗涤缓冲液洗涤细胞，并将其重悬于剩余体积（约 50 μl）中。每种染色条件添加一份（10 μl）生物素标记的五聚体。在室温下孵育 10 – 15 分钟。用 10 倍体积的洗涤缓冲液洗涤细胞。添加最佳滴定量的荧光标记链霉亲和素和抗 CD8每个染色条件下的抗体。在冰上孵育 20 – 30 分钟避光。用洗涤缓冲液洗涤细胞两次，并将其保存在黑暗中的固定溶液中。细胞现在已准备好进行流式细胞术分析。最方便地观察五聚体阳性细胞的方法是，首先对活淋巴细胞进行门控，然后对 x 轴上显示 CD8、y 轴上显示五聚体的双色图进行分析。
未标记 Pro5 的细胞染色方案® MHC 五聚体加 Biotag（3 层染色）所需材料洗涤缓冲液（0.1% 叠氮化钠、0.1% BSA 的 PBS 溶液）、固定溶液（1% 胎牛血清、2.5% 甲醛的 PBS 溶液）、未标记的 Pro5®对所选抗原具有特异性的五聚体、Pro5® Biotag、荧光标记的链霉亲和素缀合物、抗 CD8 抗体（与链霉亲和素缀合物具有不同的荧光）。
每个分配 1-2 x 106 个淋巴细胞（PBMC 或脾细胞）染色条件。 （由于抗原特异性 T 细胞的频率很高，因此在使用 T 细胞克隆或细胞系时，每个染色条件仅分配 2-5 x 105 个细胞）。洗涤缓冲液并将其重悬于剩余体积（~ 50 μl）中。每种染色条件添加一份未标记五聚体测试（2 μl）。在室温下孵育 10 – 15 分钟。用 10 倍体积的洗涤缓冲液洗涤细胞。添加一份（8 μl）Pro5® Biotag。在冰上孵育 20 – 30 分钟。根据染色条件添加最佳滴定量的荧光标记链霉亲和素和抗 CD8 抗体。在冰上避光孵育 20 – 30 分钟.用洗涤缓冲液洗涤细胞两次，并将其储存在黑暗中的固定溶液中。细胞现在已准备好进行流式细胞术分析。最方便地观察五聚体阳性细胞的方法是，首先对活淋巴细胞进行门控，然后对 x 轴上显示 CD8、y 轴上显示五聚体的双色图进行分析。
珠子分离方案所需材料洗涤缓冲液（0.1% 叠氮化钠、0.1% BSA 的 PBS 溶液）、链霉亲和素珠（例如 Polymer Labs 的 Lodestars 2.7 链霉亲和素；Dynabeads M-280 链霉亲和素 from Dynal Biotech）。为了获得最佳结果，从至少 1 x 107 个淋巴细胞（PBMC 或脾细胞）开始。
用洗涤缓冲液洗涤细胞，并重悬于 200ml 洗涤缓冲液中。每 2 x 106 个细胞添加 1 个测试（10 μl）生物素标记的五聚体。孵化室温下 10 分钟。在洗涤缓冲液中洗涤细胞，并重悬于 500 μl 洗涤缓冲液中。添加最佳滴定量的链霉亲和素珠（建议至少 5 个珠子/细胞）。在冰上孵育 30 分钟并混合。用洗涤缓冲液将管中的体积增至 2 ml，然后放入磁粉分离器中。放置 3-5 分钟。如果需要，可以保留上清液进行流式细胞术分析，以确认抗原特异性细胞的去除。用洗涤缓冲液洗涤含有珠-细胞复合物的级分 3 次，并丢弃上清液。分离的珠-细胞复合物可以放入细胞中培养物，几天后珠子应解离。
固体表面固定方案所需材料磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS)、链霉亲和素、0.1M 碳酸氢钠 (NaHCO3)、Tween-20、牛血清白蛋白 (BSA)。
用 100 ng/孔链霉亲和素（100 μl/孔）包被固体表面（例如 ELISA 板） 96 孔 ELISA 板），在 0.1 M NaHCO3，pH 8.2，4℃ 下孵育过夜。用 PBS / 0.05 % Tween-20 清洗表面 3 次。用 5 % BSA / PBS 封闭（200 μl/96 孔板孔） ELISA 板）并在室温下孵育 1 小时。用 PBS / 0.05 % Tween-20 洗涤表面 3 次。添加 50ng/孔生物素标记的五聚体（或根据需要进行滴定）并在室温下孵育 1 小时。洗涤用 PBS / 0.05 % Tween-20 清洗表面 3 次，然后继续进行所需的测定。本文链接： https://www.ebiomall.cn/b219-proimmune/info-1529380960.html
