苏州蚂蚁淘生物科技有限公司成立于2017年，致力于将全球领先的创新产品和前沿技术带入中国，帮助国内科研工作者在第一时间接触世界范围内的技术革命，并分享研发工具的进步带来的技术红利。依托于集团公司深厚的资源和超过400家的国内优质客户群体，生命科学领域的一站式供应链体系，以及高风险生物危险材料进出口平台的优势，蚂蚁淘生物严格筛选国际创新且经过同行验证过的产品和技术，引入中国市场，开发、孵育和推广。公司的未来将立足于实验室大数据整合和电子商务，结合严格的品牌筛选、创新的营销模式、专注的应用支持和坚实服务，帮助实现生命科学产业链的简单和高效。

Biosettiafocusesonthedevelopmentandcommercializationofuniquetechnologiestoprovidebettersolutionsforlifescienceresearch.Thecompanyendeavorstoprovideinnovativetoolsandspecialtyreagentstoaidingenome-widefunctionalanalysisandgenerationofinducedpluripotentstemcells(iPSC).Theseinclude:single-strandRNAitechnology,microRNAexpressionsystems,normalizedfull-lengthcDNAlibrariesandlentiviraldeliverysystems.Inadditiontoprovidingreagentsandservicestothemanyacademicinstitutes,biotechandpharmaceuticalcompanieswehaveextendedourresearchanddevelopmenteffortstothefieldsofstemcellresearch,identificationofcancerbiomarkers,anddiscoveryofnextgenerationdrugtargetsbiosttia是一家总部位于圣地亚哥的公司，提供分子生物学产品和服务，支持全球的研究人员。利用我们高效的慢病毒系统，我们协助许多学术机构、生物技术和制药公司进行基因表达和抑制相关研究。Biosettia专门从事：shRNA载体系统的基因沉默慢病毒miRNA对基因的抑制作用慢病毒miRNA的功能筛选miRLocker–慢病毒miRNA抑制慢病毒的制备慢病毒基因表达诱导多能干细胞生成核酸纯化

shRNA比siRNA的优势包括能够使用病毒载体进行转染，克服了某些类型的细胞不能转染的难题，能选择使用诱导型启动子控制shRNA表达，能够与报告基因共表达。此外，它们能减少脱靶效应（在下面进一步讨论）。

一般方案设计siRNA和shRNA

许多实验室已发表了用于转染的长双链RNA的合成方案。但是，每种方法的效力是依赖于整个系统的。此外，长双链RNA会激活先天免疫反应，导致细胞死亡。影响shRNA活性的因素，包括环结构，发夹结构热力学性质，二级结构以及周围序列。siRNA和shRNA之间进行选择时，要考虑的一个重要因素是实验时间的长短。siRNA在细胞中瞬时表达的，而shRNA可以通过病毒介导的转导保持稳定。

siRNA/shRNA设计指导在主要RNAi产品制造商那里都能获得

• 19-29个核苷酸的siRNA序列通常是最有效的。长于30个核苷酸可导致非特异性沉默。
• 识别的理想位点包括靶mRNA序列中的AA二核苷酸区和3\'端19个核苷酸的位点。通常情况下，siRNA与3’端为dUdU或者dTdT的游离碱基的mRNA结合效率更高。较新的数据表明，其他种类的二核苷酸也可保持活性，但siRNA能够被核糖核酸酶在单链的G残基处裂解，因此应避免GG结构。
• 由于mRNA往往高度折叠并于调控蛋白结合的，应该要在不同位点选择至少2-4个靶序列。避免设计含有4-6个poly（T）的序列，因为它会作为RNA合成酶III的终止信号。
• 检查以确保您的siRNA序列与其他编码序列没有同源性。
• 序列中的G/C含量应该在35-55％之间。

公司/组织程序名称描述链接

ThermoScientific	siDESIGN	方便使用的siRNA设计工具。允许选择siRNA识别的区域（5’或3’UTR或ORF区），G/C百分比，可通过BLAST搜索序列。	链接
Naitoetal.	siDirect	根据核苷酸序列识别目标，提供了序列内的位置，可供选择双链的熔解温度，脱靶序列的不匹配的最小数目。	链接
Invitrogen	BLOCK-ITRNAiDesigner	在核算序列内识别siRNA,shRNA和miRNA目标。也可将siRNA序列转化为shRNA序列。	链接
InvivoGen	siRNAWizard	可搜索一段编码序列作为siRNA序列，可根据您的siRNA序列设计加扰序列和发夹插入。	链接
IDT	shRNA设计工具	shRNA设计工具能允许您在四个环序列中选择或者输入一段定制序列，也可以指定5’端和3‘端的酶切位点。	链接
GeneLink	shRNA设计工具	shRNA设计工具能允许您在三个环序列中选择或者输入一段定制序列，也可以指定5’端和3‘端的酶切位点，设计GC含量和长度。	链接

表二：siRNA和shRNA设计程序。

shRNA应包含正义和反义序列（每个为19-21个核苷酸的长度）由环结构分隔，以及5\'端AAAA的游离片段。设计环结构时，Ambion的科学家和其他人建议使用9nt的空白间隔（TTCAAGAGA），而Invivogen在某些载体中采用了长度为7nt的环（TCAAGAG），这可根据您的系统变化。3〜9个核苷酸长度的环序列被证明是有效的。此外，当创建shRNA盒时，正义链首先合成，然后是间隔序列，最后是反义链。shRNA结构中5\'端游离应避免，因为它们可能会导致shRNA的沉默。除了手动设计siRNA或shRNA，也有一些设计程序可供使用。他们中有几个包含在表二中了。此外，多个公司提供预制的siRNA和shRNA序列（代表性例子见表三）。

多数shRNA通过载体转录而来。表达最常见的是由聚合酶IIIU6启动子驱动，它驱动高水平的组成型表达，或由较弱的H1启动子驱动。与siRNA系统相比，shRNA的一个主要优点是，shRNA可设计为诱导性的。有商品化的四环素-开和四环素-关诱导系统，以及结构含有改良的U6启动子由昆虫蜕皮类固醇性激素蜕皮激素诱导。一个Cre-Lox重组系统已被用来实现小鼠体内的可控制表达。也有合成的shRNA可用，它不像病毒载体递送分子，可以通过如上所述的siRNA分子一样，能够通过化学修饰影响其活性和稳定性。

公司/机构程序名称他们能提供什么Link

TheBroadInstitute（可通过Sigma-Aldrich和Thermo-FisherScientific进入）	RNAi联营（TRC）	通过公共-私人的努力，目的是创造一个经验证的shRNA文库和可用于确定人和小鼠基因功能的关联工具	链接链接到RNAi联营shRNA文库:链接
Sigma-Aldrich	功能基因组&RNAi（与TRC协同）	提供细菌甘油存储、质粒DNA和慢病毒形式的TRCshRNA	链接
Thermo-FisherScientific	SMARTchoice,GIPZ,TRIPZInducible,和TRC慢病毒shRNA选项	提供细菌甘油存储和慢病毒形式的TRCshRNA。	链接

表三：提供预制的siRNA和shRNA的公司。对照

为确保RNA干扰（RNAi）处理后观察到的效应是基因沉默的结果，而不是仅仅因为引入的siRNA/shRNA，或由于RNA干扰途径激活造成的，很重要的一点在于设置相应的对照组（表三）。两种最常见的对照是加扰对照（ScrambledControl）和非识别对照（Non-targetingControl）。加扰对照正像它听起来的那样，包含获取siRNA或shRNA序列然后随机重新排列其核苷酸序列。非识别对照，在另一方面，也是一个siRNA/shRNA序列，它被设计成不能锚定靶生物的任何已知的基因。这些对照激活了RNAi机制，使得导入的双链RNA对基因表达有基本的影响。然而，应该指出的是，即使是非识别siRNA对照也会诱导细胞内的应激反应。虽然这两种类型的对照序列都将被纳入Dicer并激活RNAi途径，但加扰对照可能会针对一个预料不到的mRNA。因此，在设计加扰对照序列的时候要特别小心，以确保遵循上述原则，且不会锚定其他的mRNA序列。

对于shRNA，另一个重要的对照包括空载体对照，它不包含任何shRNA插入，却能保证转染/转导对基因表达的影响以及细胞的反应。最后，未经处理的细胞（无转染或转导）可作为参照比较其他细胞。这能允许您确定特定的siRNA转运方法的细胞毒性。

公司/机构描述

Sigma-Aldrich	shRNA非识别对照
空载体对照
ThermoScientific	shRNA阳性对照（识别eGFP）
空载体对照
Invitrogen	加扰siRNA对照
	肌动蛋白,GAPDH,或GFP阳性对照

表四：RNAi对照。转运

确切的siRNA或shRNA转运方案取决于您正在使用的细胞类型，因为不同类型的细胞核酸摄取的敏感性不同，包括您是否利用siRNA或shRNA介导的沉默，以及您正在做的实验的时间长度。转染、电穿孔、以及某些病毒转运方法是瞬时的，而慢病毒或逆转录病毒转导可将shRNA稳定整合到细胞基因组中实现持续表达。

质粒DNA或双链RNA的转染或电转

转染和电穿孔是其中最常见的核酸转运方式。转染涉及核酸与载体分子复合物的形成，使它们能够穿过细胞膜。质粒编码的siRNA，有时也有shRNA，通常使用这种方法进入到细胞。商品化的转染试剂可以购买或在实验室自己制备。

• 脂质转染。具有长疏水链头部带正电荷基团的阳离子脂质体与带负电荷的siRNA相互作用，在脂双分子层环绕siRNA，随后被细胞内吞。
• 基于阳离子聚合物的纳米粒子。
• 这可降低毒性，提高效率，并且能够转运修饰的siRNA。
• 脂质或细胞穿透肽（CPP）结合。这涉及到siRNA与疏水性基团（如胆固醇）或阳离子CCP（如转运蛋白或pentatratin）的结合，能够促进向靶细胞的转运。

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