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BiotiumTech 提示：避免 DAPI 和 Hoechst 的 UV 光转化产生的伪影 - Biotium
2025-11-20
技术提示：避免 DAPI 和 Hoechst 的 UV 光转换产生的伪影分享文章与同事分享这篇文章。复制链接发送电子邮件多色成像实验中的串扰和特异性荧光通道之间的串扰是多色成像实验的一个重要问题。在多个检测通道中检测一种染料的荧光会导致信号的人为共定位。串扰通常是由于染料激发和发射光谱的重叠而发生的，可以通过仔细匹配染料选择和仪器滤光片、滴定探针以防止信号过亮以及对每个通道单独成像以防止交叉激发来控制。不同的激光线。在任何多色成像实验中，单染色对照（用每个探针单独染色的单独样品）对于确保串扰最小化至关重要。光转换：来自 DAPI 和 Hoechst 的意外串扰来源另一个来源研究人员可能不太熟悉的串扰是染料光转化。这是由于荧光团暴露在光线下而导致的荧光团光谱特性的变化。常用的蓝色荧光核染料 DAPI 和 Hoechst 通过紫外线诱导的光转化形成绿色和红色荧光团（Żurek-Biesiada 等人 2013 年，Karg 和 Golic 2017 年）。许多显微镜学家习惯于在其他通道中观察荧光之前，使用带有紫外线激发的落射荧光来观察和聚焦 Hoechst 或 DAPI 染色的细胞核。这种做法会导致 DAPI 和 Hoechst 在 DAPI 通道和 FITC 或 Cy®3 通道中发出荧光。虽然它比原来的蓝色染料荧光亮度低得多，但来自光转换产物的绿色核信号可能会干扰其他荧光探针或标记抗体的成像，特别是对于低丰度目标，表现为虚假核定位。基于甘油的封固剂，which 通常包括 DAPI 作为复染剂，增强紫外线诱导的光转化。DAPI 在暴露于紫外线后光转化为绿色和红色荧光。用 DAPI 染色的固定和透化 HeLa 细胞在通过 DAPI 滤光片立方体暴露于汞灯激发 3 分钟之前或之后通过共聚焦显微镜成像。避免来自 DAPI 和 Hoechst 的伪影DAPI 和 Hoechst 在暴露于紫外线波长后进行光转换，但不再激发FITC 滤光片立方体或 405 nm 激光线等波长。一旦意识到光转化为绿色荧光的可能性，就可以通过仔细的成像实践避免伪影。人们可以在切换到 DAPI 通道之前对绿色荧光进行成像，或者在对样品进行紫外线照射后在对绿色通道成像之前移动到未曝光的视野。使用 EverBrite™ Hardset 等硬质封固剂代替基于甘油的湿式封固剂可以减少光转化（Robert等人。 2019）。如果使用 405 激光线的共聚焦成像是一种选择，则可以避免使用落射荧光来检测 DAPI 或 Hoechst，不幸的是，这牺牲了它们作为寻找和聚焦细胞的辅助工具的效用。最后，重要的是包括蓝色核复染剂的单一染色对照，特别是在其他通道中检测低丰度或核目标时。RedDot™1 和 RedDot™2 远红核复染剂替代远红核复染剂，例如 Biotium 的 RedDot ™1和RedDot™2，避免了DAPI和Hoechst的紫外光转化问题。 RedDot™1 具有细胞膜渗透性，可用于活细胞的核染色，而 RedDot™2 是固定和透化细胞的复染剂。 RedDot™2 不透细胞膜，也可用于死细胞的选择性染色。 RedDot™1 的一个缺点是它比常用的药物更具细胞毒性d Hoechst 33342（也可从 Biotium 获得），它仍然是对培养数小时以上的细胞进行核染色的更好选择。与所有远红外染料一样，RedDot™1 和 RedDot™2 荧光对人眼不可见，必须使用 CCD 相机或共聚焦显微镜在 Cy5 通道中成像。从好的方面来说，RedDot™1 和 RedDot™2 发射光谱与绿色荧光染料和探针的分离度非常好，进一步降低了荧光串扰产生伪影的可能性。此外，他们还留下了可见的蓝色荧光通道，用于检测其他目标。ReferencesKarg, T.J.和戈利奇，K.G. (2018)。 DAPI 和 Hoechst 染料在暴露于紫外线激发后光转化为绿色和红色发光形式。染色体 127 (2)：235–245.Roberts, L. (2019)。避免 DAPI 的 UV 光转换产生伪影的提示。今日显微镜，27（5），18-24。 doi:10.1017/S1551929519000804Żurek-Biesiada, D.、Kędracka-Krok, S. 和 Dobrucki, J. W. (2013)。 Hoechst 33258、DAPI 和 Vybrant DyeCycle 荧光染料的紫外线激活转化为蓝色激发、绿色发射的质子化形式。细胞计数，83A：441–451。 doi:10.1002/cyto.a.22260下载 RedDot™1 和 RedDot™2 传单
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