转染克隆的
G418
筛选和分离
对于需要建立某些基因已经整合到染色体
DNA
（通过稳定或永久转染）
的细胞系来说，
理想的是使用选择标记，通常也是必要的。虽然有许多标记可利用，但
G418(
氨基糖苷类抗
生素
)
为稳定转染试验提供了一种通用方便的选择。
G418
是一种氨基糖苷类似物，在结构上
与新霉素、
庆大霉素和卡那霉素相似，
它通过干扰核糖体功能来阻止哺乳动物细胞蛋白质的
合成。因此在哺乳动物细胞中表达细菌
APH
（氨基糖苷类磷酸转移酶）基因将产生
G418
的
解毒作用。
这一程序提供了建立
G418
选择条件的一般性指导，特殊条件由研究者个人决定。
1.
建立死亡曲线，确定最佳筛选浓度（参考建立方法见附录）
；
2.
细胞铺板
：转染后
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小时将贴壁的细胞传代（传代时，注意通过在显微镜下观察，控
制细胞密度，
不能使细胞太密集，
应该少于生长表面的
50%
，
参考为
20%-30%
）
至
15cm
培养皿，加入
15~20ml
培养基（
DMEM
，含血清）进行培养；
3.
用最佳筛选浓度的
G418
对细胞进行筛选
：铺板完成后，再过
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小时，抗性表达，用最
佳筛选浓度的
G418
进行筛选（对于
Hela
细胞，一般筛选终浓度为
800ug/ml
）
。具体操
作是去除旧的培养基，用
PBS
洗一次，将含有浓度为
800ug/ml
（以
Hela
为例）的培养
基
15~20ml
加入培养皿内即可；
4.
换液
：每日及时观察细胞，根据培养基的颜色和细胞生长情况，及时更换相同浓度
（
800ug/ml
）的培养基，大概持续筛选一周左右，直至空白对照组（未转染组）细胞死
亡大部分（至少
30%
以上）
；
5.
撤药维持阶段
：待空白组细胞大部分死亡后，将实验组（转染组）进行换液，此时所用
培养基含
G418
的终浓度为
200ug/ml
（维持浓度）
，维持生长（若细胞仍有死亡，需要
继续降低药的浓度，参考为
50-100ug/ml
）
，直至筛选克隆可见为止（大约
2~3
天）
；
6.
分离克隆以获得最大数量细胞（提高克隆成活可能性）
，减少单个克隆受其他细胞污染
的机会。具体操作是
：
a.
用
PBS
洗含有克隆的培养物，圈出欲分离的克隆。从培养皿中
除去液体，
准备
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孔板收集克隆；
b.
从培养皿中用牙签或者棉棒
（经过高压）
挑取已分
离出的克隆（具体操作是先用棉棒蘸一下胰酶，再蘸一下克隆）
；
c.
在
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孔板的一个孔
中（事先已加入完全培养基，不含
G418
）剧烈摇动牙签，使细胞沉于孔中，继续挑取
下一个克隆；
7.
CO2
孵箱，温育细胞约两小时
；
8.
两小时后，镜检培养皿，确定细胞是否附着
。如果已经附着，用新鲜完全培养基（含
50ug/mlG418
）
更换
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孔板培养基，
除去残留的胰蛋白酶，
继续培养直到培养物长满；
9.
一旦小量培养物长满，转接到大的培养皿（通常先是
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孔板）
，用
50ug/ml
的新鲜完全
培养基维持培养，然后与同样类型的其他细胞一样处理即可
。
