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常见问题解答：◆这款胎牛血清的试用范围？
适用于一般细胞，肿瘤细胞，部分干细胞等。◆如何储存和解冻血清才不会使产品质量受损?血清解冻时应将血清从-15~-70℃的低温冰箱中取出放入4℃冰箱解冻1天，待全部解冻后再分装。解冻过程中请不时摇匀（小心勿造成气泡），使血清成分和温度均匀，从而减少沉淀的产生。若一次无法用完一瓶，建议无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻，并避免反复冻融。需要长期保存的血清必须储存于-20℃ - 70℃ 低温冰箱中。4℃冰箱中保存时间切勿超过1个月。切勿将血清在 37℃放置太久,否则血清会变得浑浊,同时血清中的有效成分会被破坏，而影响血清质量。◆有时在血清中见到的絮状沉淀可能是些什么物质？主要是血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成,这些絮状物不会影响血清本身的质量，可用400 xg离心5 min去除，也可不用处理。◆如何避免血清中产生沉淀?(1)解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。(2) 血清分装冻存时，须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一。(3) 勿直接由-20℃直接至37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。(4) 勿将血清置于37℃太久，否则血清会变得浑浊，同时血清中许多较不稳定的成份也会因此受到破坏，从而影响血清的品质。(5) 血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。(6) 若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。◆在使用前是否需要对血清进行过滤？一般厂商提供的血清为无菌,无需再过滤除菌。如发现血清有悬浮物,则可将血清加入培养液内一起过滤,切勿直接过滤血清。◆自然溶化好的胎牛血清放在室温下一晚还能用吗？室温不可以，建议4℃保存。◆加到培养基中的血清必须灭活吗？不是必须的，看做什么实验。如果用于培养普通细胞，血清一般是不需要灭活的，这样可以有效保存血清中的生长因子。但是如果用于培养一些表面具有补体受体的细胞，如内皮细胞，血清是需要灭活，一般是56℃，30min。◆热灭活对血清的作用是什么？热灭活步骤能够灭活补体系统。补体会参与以下事件中：溶解细胞事件，平滑肌收缩，肥大细胞与血小板释放组胺，吞噬作用增强，趋化作用，淋巴细胞与巨噬细胞的活化等。◆细胞培养 中出现黑点是污染吗?如何处理?一旦您在细胞培养的过程中发现有黑点生成，首先，要肉眼观察培养基是否混浊，然后，在镜下观察培养细胞生长的状态，黑点是否游动。如果细胞被污染，微生物则会大量繁殖，培养基就会迅速变黄、变混浊。污染包括细菌污染、支原体污染等。如果在镜下观察细胞，生长状态良好，与黑点出现前相比，没有任何变化，那么，黑点的出现可能与以下几种情况有关：(1)细胞生长过老，破碎的细胞残骸;(2)血清质量不好，反复冻融的结果;(3)配制培养基的pH值偏高，不宜细胞生长;(4)配制培养基的水质、容器不合格。可应用离心、过滤的方法去除这些黑点;(5)培养原代细胞中出现小黑点，可能是原代组织中的杂质，多次传代可以消除。◆细胞培养中如何防止黑点生成?(1) 尽可能地减少血清冻融次数。(2) 培养基无需37℃水浴。(3) 培养基保持最佳PH值7.0- 7.2。(4) 严格控制配制培养基的水质，容器定期刷洗。(5) 掌握细胞传代的最佳时机，细胞切勿生长过老。
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2017-12-20
北京瑞金特生物科技有限公司在发布的肝细胞培养供应信息，浏览与肝细胞培养相关的产品或在搜索更多与肝细胞培养相关的内容。 查看更多
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2018-12-26
常规组织培养法1）初代消化培养法1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合 查看更多
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2021-07-26
北京北方同正生物技术发展有限公司在发布的工程液体，缓冲液和盐溶液供应信息，浏览与工程液体，缓冲液和盐溶液相关的产品或在搜索更多与工程液体，缓冲液和盐溶液相关的内容。 查看更多
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2018-12-26
In vitro organ cultures (Nagy Lab) kidney lungs limb In Vitro Differentiation of ES Cells into: (Nagy Lab) Cardiac Muscle Neuronal Lineages Cystic Embryoid Bod 查看更多
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2021-09-08
上海泉众机电科技有限公司在发布的血管内皮细胞培养装置供应信息，浏览与血管内皮细胞培养装置相关的产品或在搜索更多与血管内皮细胞培养装置相关的内容。 查看更多
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2021-09-04
食品里的兽用抗生素残留不容小觑。统计各地食药监部门披露的抽检信息发现，在149批次兽药不合格食品中，抗生素超标或使用违禁抗生素的食品达127个批次，涉及水产、禽、蜂蜜、肉、蛋等食品，出现率较高的有呋喃类、氯霉素类、喹诺酮类等兽用抗生素。127批食品近半数用呋喃类抗生素国家食药监总局于2月24日公布最新食品抽检结果，8批次不合格的肉类及其制品里，问题都是抗生素超标，涉及磺胺、土霉素、氟苯尼考及沙拉沙星等6种抗生素。进一步对2014年以来国... 查看更多
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2021-09-04
自 1950 年代以来，电磁场刺激便时常被用于促进骨折愈合。一般认为该方法可抑制破骨细胞的活性，刺激血管形成，促进骨形成。甚至曾有双盲随机对照研究证实脉冲式电磁场刺激对于胫骨干骨折延迟愈合具有促进作用 [1]。然而，JBJS 最新的一项多中心双盲随机对照研究显示，脉冲式电磁场刺激对于新鲜胫骨干骨折的愈合并没有明显的促进作用。 该研究共纳入了 6 个医院的 2 查看更多
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2018-07-18
兔子胶原酶II(Collagenase II)ELISA KitRabbit Collagenase Type II ELISA Kit 查看更多
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2019-03-07
冻存和复苏的原则：慢冻快融当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。慢冻程序1. 标准程序：采用细胞冻存器当温度在-25 ℃以上时， 1~2 ℃/min；当温度达-25 ℃以下时， 5~10 ℃/min；当温度 查看更多
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2021-08-02
为了您可以及时了解您所需要的细胞信息，建议直接细胞管理员，获取HBMEC细胞培养说明书、HBMEC细胞价格、HBMEC细胞培养条件、HBMEC细胞培养操作注意事项等问题。时可将您不清楚不确定的问题咨询我们的细胞管理员，您将会得到zui专业准确的建议指导与回复，帮助您养好细胞！HBMEC细胞培养注意事项（HBMEC细胞购买） 细胞包装：复苏细胞（T25培养瓶×1常温运输）冻存细胞（冻存管、干冰包装）脑是一个复杂的系统。【HIB 查看更多
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2021-09-03
抗生素耐药性传播图。图片来源：《自然》研究人员发现，全世界范围内的细菌都存在一种抵抗粘菌素—— 一种“终极”抗生素——的基因。相关研究发现于11月份来源于中国，随后在丹麦、荷兰、法国和泰国也发现了类似的耐药基因。尽管此次发现让人担忧，但是它们可能并不像很多媒体报道的那样会带来灾难性的后果，因为粘菌素只是在人体中用量非常稀少的几种抗生素之一。这项发现“带来了很糟糕的消息，但是却不至于大难临头”，美国盐湖城犹他大学传染病医生Makoto J... 查看更多
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2018-12-26
原代椎间盘细胞培养其实并不太难，但培养时间相对较长，所以容易出问题。1 选材很关键选用胎儿椎间盘进行原代培养相对容易一些，可利用反复传代的方法来制作退变模型。直接选择人退变椎间盘进行培养时（一般选择手术摘除的椎间盘），患者的年龄及间盘的退变情况必须充分考虑在内。若年龄偏 查看更多
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McIlvaine缓冲液 123
jop975642017-10-03
McIlvaine缓冲液属于广域缓冲溶液，pH调节范围在3～8之间，缓冲范围较大，可以用于多种用途，例如线粒体的分离染色等。Leagene的McIlvaine缓冲液(pH4.1)主要由磷酸氢二钠和柠檬酸组成，pH4.1，属于最常用的一种广域缓冲溶液。
为什么血清能解蛇毒,什么原理?此方法是不是能解所有的蛇毒?_百度...123
2017-09-28
刚电视上看了蛇类的介绍，说蛇毒有神经麻痹的、内脏器官衰竭、引起大出血什么的...想问下被咬到的话，有没有一个通用的解毒或缓解的方法
谁的答案详细、真实分就给谁...(勿灌水，否则必究之)
谁的答案详细、真实分就给谁...(勿灌水，否则必究之)
[新版]对二氯苯123
cici一葵2017-09-28
除虫剂白色的晶体状是什么物质？我查了一下百度说是对二氯苯请问对二氯苯有挥发性吗？要是沾在吃饭的碗上了了可怎么办？
代谢组学检测选择血清还是血浆样本呢?_肿瘤细胞_氨基酸代谢_非...123
oujiay2021-07-28
想做临床的血标本的一些代谢组学研究，不知道应该用血浆还是血清，大家的说法好像也不太一致，请大神指导啊，最好有些参考文献，谢谢！
【讨论】关于冻存试剂的解冻方法 实验室建设与采购论坛123
msgcl2021-08-03
大家好，我想请问下大家，-20℃或其他冻存的试剂如何解冻更好呢？希望得到大家的帮助，谢谢。
基于FRET原理的高灵敏度DNA纳米荧光探针的合成及性能研究国家自...123
2008sl20112021-08-04
检测原理：该试剂盒是一种时间分辨的荧光共振能量转移免疫分析，该反应是一个竞争免疫反应，即铕标的cAMP示踪复合物与体系中的cAMP竞争结合标有Alexa Fluor 647染料的cAMP抗体。铕标cAMP示踪复合物是通过Biotin标记的cAMP与铕标的抗生物素蛋白链菌素（streptavidin）与抗体的复合物紧密结合产生的。
当抗体结合到示踪剂上时，340nm的激发光激发铕标分子，导致能量转移到Alexa Fluor 647染料上，结果产生665nm的发射光。荧光的强度与样品中的cAMP含量成反比。
本试剂盒用于检测在GPCR激动剂刺激下活细胞或者细胞膜制备品产生的cAMP。对于偶联Gαs的受体，激动剂刺激导致665nm的荧光强度降低，而拮抗剂则可以逆转这一效应；对于偶联Gαi的受体，在激动剂刺激的同时用forskolin刺激cAMP产生，那么激动剂则抑制forskolin诱导的cAMP的生成，因此对照只给forskolin的细胞组可以通过665nm荧光强度的增加反应激动剂的效应。
该试剂盒的灵敏度很高，室温下反应在20h内是稳定的。本试剂盒适用于在384孔板中进行24μl的微量分析。
2.保存条件
避光2~4℃保存，过期时间见装。
3.盒内试剂
cAMP标准品：1管，1ml。（50μM）
生物素标记的cAMP（b-cAMP）：1管，25μl。
铕标的抗生物素蛋白链菌素：1管，25μl。
荧光标记的cAMP抗体：1管，40μl。
检测缓冲液：1瓶，25ml。
4.需要自配的其他溶液
l Hank’s balanced salt solution (HBSS): NaCl 8.0g、CaCl2 0.14g、KCl 0.4g、 KH2PO4 0.06g、Na2HPO4?7H2O0.09g、MgCl2.6H2O0.10 g、MgSO4.7H2O0.10 g、NaHCO30.35g、葡萄糖1.0g，加H2O至 1000ml (用7.5%NaHCO调节PH值=7.4)
l Versene消化液（1L）：EDTA 0.372 g，NaCl 8.0g，KCl 0.20 g，KH2PO40.20g，Na2HPO4 1.15 g，D-glucouse 0.2 g，pH 7.4
l HEPES缓冲液(1mol/L)：取2.383gHEPES溶于10ml去离子水中。
l 7.5%BSA溶液：取0.75gBSA溶于10ml去离子水中
l 0.5M IBMX溶液：11.11mg IBMX溶于100μl DMSO中，-20℃冻存。
l 刺激缓冲液（SB）：14 ml HBSS(1×)+75μlHEPES(1mol/L)+200μlBSA (7.5%)。(注：在测定细胞cAMP时，反应缓冲液中要加入IBMX 0.5mmol/L)
l 吗啡贮存液(10mM)：盐酸吗啡37.585mg溶于10ml生理盐水中，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存备用。
l 纳络酮母液(100mM)：纳络酮4mg溶于100μl 生理盐水中，用时工作液按照1:500稀释，溶剂为含有IBMX的反应缓冲液。
当抗体结合到示踪剂上时，340nm的激发光激发铕标分子，导致能量转移到Alexa Fluor 647染料上，结果产生665nm的发射光。荧光的强度与样品中的cAMP含量成反比。
本试剂盒用于检测在GPCR激动剂刺激下活细胞或者细胞膜制备品产生的cAMP。对于偶联Gαs的受体，激动剂刺激导致665nm的荧光强度降低，而拮抗剂则可以逆转这一效应；对于偶联Gαi的受体，在激动剂刺激的同时用forskolin刺激cAMP产生，那么激动剂则抑制forskolin诱导的cAMP的生成，因此对照只给forskolin的细胞组可以通过665nm荧光强度的增加反应激动剂的效应。
该试剂盒的灵敏度很高，室温下反应在20h内是稳定的。本试剂盒适用于在384孔板中进行24μl的微量分析。
2.保存条件
避光2~4℃保存，过期时间见装。
3.盒内试剂
cAMP标准品：1管，1ml。（50μM）
生物素标记的cAMP（b-cAMP）：1管，25μl。
铕标的抗生物素蛋白链菌素：1管，25μl。
荧光标记的cAMP抗体：1管，40μl。
检测缓冲液：1瓶，25ml。
4.需要自配的其他溶液
l Hank’s balanced salt solution (HBSS): NaCl 8.0g、CaCl2 0.14g、KCl 0.4g、 KH2PO4 0.06g、Na2HPO4?7H2O0.09g、MgCl2.6H2O0.10 g、MgSO4.7H2O0.10 g、NaHCO30.35g、葡萄糖1.0g，加H2O至 1000ml (用7.5%NaHCO调节PH值=7.4)
l Versene消化液（1L）：EDTA 0.372 g，NaCl 8.0g，KCl 0.20 g，KH2PO40.20g，Na2HPO4 1.15 g，D-glucouse 0.2 g，pH 7.4
l HEPES缓冲液(1mol/L)：取2.383gHEPES溶于10ml去离子水中。
l 7.5%BSA溶液：取0.75gBSA溶于10ml去离子水中
l 0.5M IBMX溶液：11.11mg IBMX溶于100μl DMSO中，-20℃冻存。
l 刺激缓冲液（SB）：14 ml HBSS(1×)+75μlHEPES(1mol/L)+200μlBSA (7.5%)。(注：在测定细胞cAMP时，反应缓冲液中要加入IBMX 0.5mmol/L)
l 吗啡贮存液(10mM)：盐酸吗啡37.585mg溶于10ml生理盐水中，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存备用。
l 纳络酮母液(100mM)：纳络酮4mg溶于100μl 生理盐水中，用时工作液按照1:500稀释，溶剂为含有IBMX的反应缓冲液。
在80度冰箱保存的植物叶片(大概两三个月了)还能提取出完整的叶绿体么...123
2021-08-11
可以，或者保存在液氮中
2ml细胞冻存管2ml细胞冻存管批发、促销价格、产地货源123
热情的6一路2021-08-12
师姐用的晶安生物2ml的，性价比较高，希望可以帮到您。
【求助】ELISA测细胞培养上清液蛋白浓度 细胞技术讨论版 ...123
佐至夏2021-08-01
实验室超低温冰箱需要做温度分布验证吗质量保证蒲公英制药技术...123
才嘛顶说2642021-08-07
1、注意不要放在冷凝器出风口地方，以免阻碍散热。其它地方没什么风险。2、建议实验室低温冰箱一般是用于冻存一些样品，建议周围少放杂物，以免在取样品时，杂物掉落，对实验样品造成影响。
【medicalnews】【资讯翻译】蛆虫应用于清创术中能够抑制感染并...123
shumufeng2021-07-20
http://www.medscape.com/viewarticle/755763?src=rss
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MaggotsFasterThanScalpelinWoundDebridement
December19,2011—Maggotdebridementtherapy(MDT)appearstobemoreeffectiveforwounddebridementcomparedwithconventionaltherapy,butonlyat1week;afterthattime,anothertypeofdressingshouldbeused,newresearchsuggests.
KristinaOpletalovà,MD,fromtheDepartmentofDermatology,UniversityofCaen,France,andcolleaguespublishedonlineDecember19intheArchivesofDermatology.
MedicalmaggotswereapprovedbytheUSFoodandDrugAdmiNISTrationasamedicaldeviceforwounddebridementin2004.Accordingtotheresearchers,useofmaggotsintreatingwoundsisassociatedwitheffectivewounddebridement,antibacterialeffects,andstimulationofwoundhealing.
However,theypointout,"[r]elativelyfewclinicalstudieshavebeenconductedandtheresultsarenotclear,partlyowingtomethodologicassessmentproblems."
InthecurrentProspective,randomizedcontrolled,phase3clinicaltrial,theresearcherssoughttodeterminetheefficacyofbaggedlarvaeonwounddebridementincomparisonwithconventionaltreatment.
TheprimaryobjectivewastocomparethemeanpercentageofsloughinwoundstreatedwithMDTwiththatofconventionaltreatmentatday15.Thestudyincluded119patientswithanonhealing,sloughywoundthatwas40cm2orsmallerandlessthan2cmdeep.Patientsalsohadananklebrachialindexof0.8orhigher.
Treatmentwasadministeredduringa2-weekhospitalstay.Conventionaltreatmentconsistedofsurgicaldebridement3timesaweekwithascalpel,withuseoftopicalanesthesia.TheMDTwasadministeredusinganencloseddressing(Vitapad,BioMondeLaboratories)containing80sterilemaggots.Atdischarge,aconventionaldressingwasapplied,andpatientswerefollowed-upatday30.
DebridementbyMDTwassignificantlyfasterthansurgicaldebridementduringthefirstweekoftreatment,reachingthesamelevelthecontrolgroupreachedatday15.NobenefitforMDTcomparedwithconventionaltreatmentinhealingrateswasobserved.Atday8,54.5%intheMDTgroupvs66.5%inthecontrolgroup(P=.04)hadevidenceofsloughandwoundhealing.However,byday15,themeanpercentageofsloughwas55.4%intheMDTgroupand53.8%inthecontrolgroup(P=.78).
"AthoughMDTshowsnosignificantbenefitatday15comparedwithconventionaltreatment,debridementbyMDTissignificantlyfasterandoccursduringthefirstweekoftreatment,"theresearchersconclude."Becausethereisnobenefitincontinuingthetreatmentafter1week,anothertypeofdressingshouldbeusedafter2or3applicationsofMDT."
Painscoresweresimilarandmildinbothgroups,althoughincontrasttoconventionaltreatment,MDTwasperformedwithouttopicalanesthesia.
Accordingtotheresearchers,noneofthepatientswerereticentaboutundergoingMDT."[A]crawlingsensationonthewoundwasrarelyandalmostequallynotedinbothgroups,revealingthatthesensationwassubjective,"Dr.Opletalovàandcolleaguespointout.
TwoquestionsregardingMDTremainunanswered,theauthorsnote."Candebridementbeimprovedusingmoremaggotsperdressing?Ifso,wouldthesedressingsbemorepainful?Furtherstudiesareneededtoanswerthesequestions."
ThestudywassupportedbygrantsfromtheClinicalResearchHospitalProgramandfromtheFrenchSocietyofDermatology.Theauthorshavedisclosednorelevantfinancialrelationships.
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MaggotsFasterThanScalpelinWoundDebridement
December19,2011—Maggotdebridementtherapy(MDT)appearstobemoreeffectiveforwounddebridementcomparedwithconventionaltherapy,butonlyat1week;afterthattime,anothertypeofdressingshouldbeused,newresearchsuggests.
KristinaOpletalovà,MD,fromtheDepartmentofDermatology,UniversityofCaen,France,andcolleaguespublishedonlineDecember19intheArchivesofDermatology.
MedicalmaggotswereapprovedbytheUSFoodandDrugAdmiNISTrationasamedicaldeviceforwounddebridementin2004.Accordingtotheresearchers,useofmaggotsintreatingwoundsisassociatedwitheffectivewounddebridement,antibacterialeffects,andstimulationofwoundhealing.
However,theypointout,"[r]elativelyfewclinicalstudieshavebeenconductedandtheresultsarenotclear,partlyowingtomethodologicassessmentproblems."
InthecurrentProspective,randomizedcontrolled,phase3clinicaltrial,theresearcherssoughttodeterminetheefficacyofbaggedlarvaeonwounddebridementincomparisonwithconventionaltreatment.
TheprimaryobjectivewastocomparethemeanpercentageofsloughinwoundstreatedwithMDTwiththatofconventionaltreatmentatday15.Thestudyincluded119patientswithanonhealing,sloughywoundthatwas40cm2orsmallerandlessthan2cmdeep.Patientsalsohadananklebrachialindexof0.8orhigher.
Treatmentwasadministeredduringa2-weekhospitalstay.Conventionaltreatmentconsistedofsurgicaldebridement3timesaweekwithascalpel,withuseoftopicalanesthesia.TheMDTwasadministeredusinganencloseddressing(Vitapad,BioMondeLaboratories)containing80sterilemaggots.Atdischarge,aconventionaldressingwasapplied,andpatientswerefollowed-upatday30.
DebridementbyMDTwassignificantlyfasterthansurgicaldebridementduringthefirstweekoftreatment,reachingthesamelevelthecontrolgroupreachedatday15.NobenefitforMDTcomparedwithconventionaltreatmentinhealingrateswasobserved.Atday8,54.5%intheMDTgroupvs66.5%inthecontrolgroup(P=.04)hadevidenceofsloughandwoundhealing.However,byday15,themeanpercentageofsloughwas55.4%intheMDTgroupand53.8%inthecontrolgroup(P=.78).
"AthoughMDTshowsnosignificantbenefitatday15comparedwithconventionaltreatment,debridementbyMDTissignificantlyfasterandoccursduringthefirstweekoftreatment,"theresearchersconclude."Becausethereisnobenefitincontinuingthetreatmentafter1week,anothertypeofdressingshouldbeusedafter2or3applicationsofMDT."
Painscoresweresimilarandmildinbothgroups,althoughincontrasttoconventionaltreatment,MDTwasperformedwithouttopicalanesthesia.
Accordingtotheresearchers,noneofthepatientswerereticentaboutundergoingMDT."[A]crawlingsensationonthewoundwasrarelyandalmostequallynotedinbothgroups,revealingthatthesensationwassubjective,"Dr.Opletalovàandcolleaguespointout.
TwoquestionsregardingMDTremainunanswered,theauthorsnote."Candebridementbeimprovedusingmoremaggotsperdressing?Ifso,wouldthesedressingsbemorepainful?Furtherstudiesareneededtoanswerthesequestions."
ThestudywassupportedbygrantsfromtheClinicalResearchHospitalProgramandfromtheFrenchSocietyofDermatology.Theauthorshavedisclosednorelevantfinancialrelationships.
细胞冻存、解冻方法与细胞计数(虽基础但重要)123
zjlijing2021-07-24
细胞冻存、解冻方法与细胞计数
一、细胞冷冻保存
1.材料：
生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(SigmaD-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4％（w/v）trypanblue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII)
2、冷冻保存方法：
（1）传统方法:冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16～18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase长期储存。
-20℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
（2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。
3、步骤：
（1）冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。
（2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMSO）至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。
（3）离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。
（4）取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％），使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1～2ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。
4、注意事项：
（1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为80～90％致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
（2）细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力；在-70度可保存数月。
（3）注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如SigmaD-2650)，以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液，可避免DMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗，可降低细胞受损。DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化，可换用10%甘油冻存。
（4）冷冻保存之细胞浓度：
①normalhumanfibroblast:1～3×106cells/ml
②hybridoma:1～3×106cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。
③adherenttumorlines:5～7×106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1～3×106cells/ml
④othersUSPensions:5～10×106cells/ml，humanlymphocyte须至少5×106cells/ml。
（5）冷冻保护剂浓度为5或10％DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backupculture，以防止冷冻失败。
（6）冻存可用10%～90%的血清，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而少沉积（4度时），复苏存活率在80%～90%以上，对原代培养细胞，以90%血清冻存更为有效。
二、冷冻细胞活化
1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。
2、细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。
3、材料
37℃恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器
4、步骤：
（1）操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。
（2）自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。
（3）将新鲜培养基置于37℃水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。
（4）取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。
（5）取出解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10～1:15)，混合均匀，放入CO2培养箱培养。取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。
（6）解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol)，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内，离心1000rpm，5分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2培养箱培养。
（7）若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。
三、细胞计数与存活测试
1、原理：
（1）计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。
（2）血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。
（3）存活测试之步骤为dyeexclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypanblue染料，如果细胞不易吸收trypanblue，则用红色之Erythrosinbluish。计算细胞活率：活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分活细胞也开始摄取染料；因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。
2、材料：
0.4%w/vtrypanblue(GibcoBRL15250-061)；Erythosinbluishstain；取0.1gramErythrosinbluish(SigmaE-9259)及0.05grampreservativemethylparaben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline；血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip)；计数器(counter)；低倍倒立显微镜；粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白细胞稀释液（4%乙酸溶液）。
3、步骤：
（1）取50μl细胞悬浮液与50μltrypanblue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。
（2）取少许混合液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosinbluish)。
（3）计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypanblue等体积混合)，最后乘以104，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。
注：4大格细胞总数×稀释倍数×104/4=细胞数/ml；每一大格的体积=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml
计数板计数时，最适浓度为5～10×105细胞/ml，此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液，可取出部分作稀释或连续稀释后计数。
5、范例：
T75monolayerculture制成10ml细胞悬浮液，取0.1ml溶液与0.1mltrypanblue混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。
活细胞数/方格：55，62，49，59；死细胞数/方格：5，3，4，6；细胞总数=243
平均细胞数/方格=60.75；稀释倍数=2；
细胞数/ml：60.75×104×2（稀释倍数）=1.22×106；
细胞数/flask（10ml）：1.22×106×10ml=12.2×106
存活率：225/243﹦92.6%
一、细胞冷冻保存
1.材料：
生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(SigmaD-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4％（w/v）trypanblue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII)
2、冷冻保存方法：
（1）传统方法:冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16～18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase长期储存。
-20℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
（2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。
3、步骤：
（1）冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。
（2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMSO）至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。
（3）离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。
（4）取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％），使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1～2ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。
4、注意事项：
（1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为80～90％致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
（2）细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力；在-70度可保存数月。
（3）注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如SigmaD-2650)，以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液，可避免DMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗，可降低细胞受损。DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化，可换用10%甘油冻存。
（4）冷冻保存之细胞浓度：
①normalhumanfibroblast:1～3×106cells/ml
②hybridoma:1～3×106cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。
③adherenttumorlines:5～7×106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1～3×106cells/ml
④othersUSPensions:5～10×106cells/ml，humanlymphocyte须至少5×106cells/ml。
（5）冷冻保护剂浓度为5或10％DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backupculture，以防止冷冻失败。
（6）冻存可用10%～90%的血清，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而少沉积（4度时），复苏存活率在80%～90%以上，对原代培养细胞，以90%血清冻存更为有效。
二、冷冻细胞活化
1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。
2、细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。
3、材料
37℃恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器
4、步骤：
（1）操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。
（2）自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。
（3）将新鲜培养基置于37℃水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。
（4）取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。
（5）取出解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10～1:15)，混合均匀，放入CO2培养箱培养。取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。
（6）解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol)，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内，离心1000rpm，5分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2培养箱培养。
（7）若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。
三、细胞计数与存活测试
1、原理：
（1）计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。
（2）血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。
（3）存活测试之步骤为dyeexclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypanblue染料，如果细胞不易吸收trypanblue，则用红色之Erythrosinbluish。计算细胞活率：活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分活细胞也开始摄取染料；因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。
2、材料：
0.4%w/vtrypanblue(GibcoBRL15250-061)；Erythosinbluishstain；取0.1gramErythrosinbluish(SigmaE-9259)及0.05grampreservativemethylparaben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline；血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip)；计数器(counter)；低倍倒立显微镜；粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白细胞稀释液（4%乙酸溶液）。
3、步骤：
（1）取50μl细胞悬浮液与50μltrypanblue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。
（2）取少许混合液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosinbluish)。
（3）计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypanblue等体积混合)，最后乘以104，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。
注：4大格细胞总数×稀释倍数×104/4=细胞数/ml；每一大格的体积=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml
计数板计数时，最适浓度为5～10×105细胞/ml，此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液，可取出部分作稀释或连续稀释后计数。
5、范例：
T75monolayerculture制成10ml细胞悬浮液，取0.1ml溶液与0.1mltrypanblue混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。
活细胞数/方格：55，62，49，59；死细胞数/方格：5，3，4，6；细胞总数=243
平均细胞数/方格=60.75；稀释倍数=2；
细胞数/ml：60.75×104×2（稀释倍数）=1.22×106；
细胞数/flask（10ml）：1.22×106×10ml=12.2×106
存活率：225/243﹦92.6%
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