Eliminateendotoxinsatthesource
- GeneticallymodifiedLPSdoesnottriggerendotoxicresponseinmammaliancells
- PlasmidyieldssimilartoDH10Bcells
- Idealformammaliantransfectionandproteinexpression
- Skipexpensive,timeconsumingendotoxinremovalsteps
- Frequentlyaskedquestions
- Introduction
- Genotypeinformation
- Whyendo-freeplasmidprepisnotthebestmethod
- PlasmidproductionwithClearColi
- Endotoxicity/LALlevels
- TransfectionandproteinexpressionfromClearColiPlasmids
- GrowthratesforClearColiK-12cells
- Usefulreferencearticles
- ClearColilicensinginformation
IntroductiontoClearColi®technology:
Isthereabetterwaytoeliminateendotoxincontamination?
Nowthereis.
Insteadofremovinglipopolysaccharide(LPS)contaminationfromyourproteinorplasmidDNApreparations,eliminatetheLPSatthesource. GeneticallymodifiedLPSfromanovel E.coli strainproducesfunctionallycleanrecombinantproteinsandplasmids. ClearColi®cellsarethefirstcommerciallyavailablecompetentcellswithamodifiedLPS(LipidIVA -seeFig.1)thatdoesnottriggertheendotoxicresponseinmammaliancells.ClearColicellslackoutermembraneagoNISTsforhTLR4/MD-2activation;therefore,activationofhTLR4/MD-2signallingbyClearColiisseveralordersofmagnitudelowercomparedwith E.coli wild-typecells,andplasmidDNApreparedfromClearColiisvirtuallyfreeofendotoxicactivity.AfterminimalpurificationfromClearColicells,proteinsorplasmids(whichmaystillcontain LipidIVA)canstillbeusedinmostapplicationswithoutelicitinganendotoxicresponse(seeEndotoxicityLALLevelsfordetails).
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| Figure1.TheLPSofanormalE.colicellcomparedtothegeneticallymodifiedLipidIVAfromClearColicells. InClearColi,theoligosaccharidechainhasbeendeleted,andtwoofthesixacylchainshavebeenremovedtodisabletheendotoxinsignal. |
ModificationstothegenotypeoftheClearColicellsconsistofsevenseparategenedeletions,therebyensuringthatthereisnochanceofgeneticreversionbacktowildtypeandproductionofnormalLPS. ThesemutationsresultinthedeletionoftheoligosaccharidechainfromtheLPS,makingiteasiertoremovetheresultinglipidIVA fromthedownstreamproduct. Moreimportantly,twoofthesixacylchainsaredeleted. ThesixacylchainsoftheLPSarethetriggerthatisrecognizedbytheToll-likereceptor4(TLR4)incomplexwithmyeloiddifferentiationfactor2(MD-2),causingactivationofNF-ƙBandproductionofproinflammatorycytokines. LipidIVA,whichcontainsonlyfouracylchains,isnotrecognizedbyTLR4andthusdoesnottriggertheendotoxicresponse(seeFig.2).
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Fig.2.ComparisonofrelativeNF-κBinductioninHEK-BlueCellsusingpurifiedLPSfromaK-12 E.coli strainorfrompure,syntheticallymanufacturedLipidIVA. |
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GenotypeInformation:
ClearColiK-12competentcellshavethefollowinggenotype:
F-,&lamBDa;- ΔendAΔrecAmsbA52frr181ΔgutQΔkdsDΔlpxLΔlpxMΔpagPΔlpxPΔeptA
Sevenspecificdeletionmutations(ΔgutQΔkdsDΔlpxLΔlpxMΔpagPΔlpxPΔeptA)encodethemodificationofLPStoLipidIVA,whileoneadditionalcompensatingmutation(msbA52)enablesthecellstomaintainviABIlityinthepresenceoftheLPSprecursorlipidIVA.
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WhyEndo-freePlasmidPrepisnottheBestMethod
Topreventtoxicityincellstobetransfected,plasmidsproducedin E.colimustbeessentiallyfreeofendotoxin.However,efficienteliminationofendotoxinisachallengingtask,andendo-freeplasmidprepmethodsareexpensiveandtimeconsuming. ClearColiK-12cellsproduceplasmidDNAwithendotoxinlevelslessthanorequaltoplasmidspreppedfromstandardE.colicloninglinesandQiagen'sEndofreeMaxiPrepkits.
ClearColiK-12cellsallowuseofstandardplasmidprepinsteadofendo-freemethods:
- Savesupto90%inplasmidprepcosts
- Saves1hourormoreinpreptime
- Hightransfectionandproteinexpressionlevelswithoutconcernforendotoxincontamination
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PlasmidProductionwithClearColiK-12Cells
ClearColiK-12cellsareendA-andrecA-forthehighestqualityplasmidproduction. PlasmidyieldsfromClearColiK-12cellsareequalorgreaterthanthoseobtainedfromnormalDH10Bcompetentcells. Table1comparesyieldsfrom1mLminiprepsforbothClearColiK-12andE.Cloni10G(equivalentOD'swereusedforbothpreps).
PlasmidDNAYield | |
ClearColiK-12 | 4.83µg/mL |
E.Cloni10G | 3.75µg/mL |
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Endotoxicity/LALLevels
Limulus amebocyteassaytestingisanFDA-approvedmethodfordetectionofendotoxinsandthemostcommonassayused. Asshowninfigure3,astandardplasmidpurificationstepforDNAproducedfromClearColicellsresultsinLALresponselevelslessthan1%ofthatproducedbyplasmidsderivedfromstandardDH10Bcellsandstandardprepmethods. TheEUlevelsdetectedfromClearColiK-12derivedplasmidsarealsoequivalentorlowerthantothoseobtainedfromDH10BderivedplasmidspreparedwithQiagen'sEndofreeMaxiprepkits(datanotshown).
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| Fig.3Comparisonofpost-plasmidpurificationendotoxinunitsdetectedfromClearColiK-12(redbars)andDH10B(E.cloni10G,greybars)competentcells.PlasmidDNAfromClearColidemonstratessignificantreductioninEU/mgwithouttheneedforendotoxinfreeplasmidprepkits. |
ItshouldbenotedthattheresidualEUmeasurementsarelikelyduetothenon-specificnatureoftheLALassayunlessextraneousLPScontaminationfromothersourcesispresent.TheLALassayisactivatedsolelybythe4´-monophosphoryldiglucosaminebackboneofLPS. LALactivityisminimallyinfluencedbyacylationpatternofLPS,thekeydeterminantofendotoxicityineukaryoticcells. TheLALassayalsorecognizesawiderspectrumofLPS/lipidAvariantsthanthecentralcellularendotoxinsensorsystemofthehumanimmunecellsystem. Assuch,falsepositiveresultscanandwillresultduetothelackofspecificityoftheassay.
Alternativetoxicityassays,suchasthoseusingHEK-Bluecells(seeClearColi®BL21(DE3)cellsformoreinformation)suggestthateveninthepresenceofEUlevelsabovethreshholdsnormallytargetedbyresearchers,theactualimmunogeniceffectsfromClearColi-derivedproductsarenon-existent. Duetothenon-specificityoftheLALassaywhencombinedwithlipidIVA fromClearColi,itissuggestedthatresearchersconsideralternativemethodsofendotoxinmeasurement.
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TransfectionandproteinexpressionfromClearColiPlasmids
Withtheoriginalsourceofendotoxineliminated,itisnowpossIBLetotransfectplasmidDNApreppedwithstandardmethodsdirectlyintohumanorothermammaliancelllineswithoutconcernforcellviability,alteredcellularresponsesorpoorproteinexpression. Toprovethis,aplasmid(pME-HA)containingageneencodingafluorescentproteinwasclonedintobothClearColiK-12andDH10BE.coli. TheplasmidfromClearColiwasthenisolatedviastandardQiagenMaxiprepkitmethod,whiletheplasmidfromDH10BwasisolatedusingQiagen'sEndofreeMaxiKit. TheresultingplasmidsweretransfectedintoHEK293Tcellsforproteinexpression(Figure4). Nodifferencesincellviabilityorproteinexpressionlevelshavebeenobservedwhenusinganon-endofreeplasmidprepmethodincombinationwithClearColi-derivedplasmids.
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| Figure4.ComparisonofexpressionofagreenfluorescentproteininHEK293TcellsfromClearColi-derivedplasmidsandstandardmaxiprep(left)vs.DH10B-derivedplasmidsandendofreemaxiprep(right).Theupperpanelsshowfluorescence;thelowerpanelsshowacombinedfluorescenceandbrightfieldimage. |
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GrowthRatesforClearColiK-12Cells
ClearColiK-12cellsgrowatapproximately50%oftherateofnormalDH10Bcells(seeFig.5). Usersshouldexpecttoseeverysmallcoloniesforthefirst24hoursafterplatingtransformants. Lucigenrecommendsincubatingplatesfor32-40hoursbeforepickingcoloniesforfutureexperiments. Whengrowntosufficientdensities,ClearColiK-12cellsproducesimilarplasmidyieldsasnormalDH10Bcells.
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| Figure5.ComparisonofgrowthratesforClearColiK12ElectrocompetentCellsvs.E.cloni 10GELITEElectrocompetentcells. CellsweretransformedwithpME-HA-CometandinoculatedtoaninitialOD600 of~0.01in200mLofLBMillermediumandgrownat37°Cwithshakingat210rpm.TheOD600 ofthecultureswasrecordedeveryhalfhour. |
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RelevantReferenceArticles:
- Teghanemt,etal,MolecularBasisofReducedPotencyofUnderacylatedEndotoxins,JImmunol,2005;175:4669-4676
- Mamat,etal,SingleaminoacidsubstitutionsineitherYhjDorMsbAconferviabilityto3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonicacid-depletedEscherichiacoli,MolecularMicroBIOLOGy,2008,67(3),633–648
- Meredith,etal,RedefiningtheRequisiteLipopolysaccharideStructureinEscherichiacoli,ACSChemicalBiology,2006,1(1),33-42
- Brandenburg,etal,TheExpressionofEndotoxicActivityintheLimulusTestasComparedtoCytokineProductioninImmuneCells,CurrentMedicinalChemistry,2009,16,2653-2660
- Gutsmann,etal.StructuralprerequisitesforendotoxicactivityintheLimulustestascomparedtocytokineproductioninmononuclearcells,InnateImmunity,2010,16(1),39-47
- BeomSeokPark1etal.,ThestructuralbasisoflipopolysacchariderecognitionbytheTLR4–MD-2complex,Nature458,1191-1195(30April2009)
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ClearColiLicensingInformation:
ClearColiCompetentcellsaresubjecttoUSPatent8,303,964andotherUSandforeignpendingpatents.
LucigenCorporation("Lucigen")hasalicensefromResearchCorporationTechnologiestosellClearColicompetentcellstothird-partiesfornon-commercialresearchpurposesonly.Aseparatelicenseisrequiredforanycommercialuse.Formoreinformationabouttheuseofthisproductbycommercialentities,pleasereviewour fulllicensingpage.
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ORDERINFORMATION
EachClearColi®K-12ElectocompetentCellKitcontains:ClearColiK-12ElectrocompetentCellsinDUOpackaging(2transformationspertube),RecoveryMedium,andpUC19PositiveControlPlasmid. Completeprotocolsareavailableonlineatwww.lucigen.com/manuals.
RecoveryMediumisalsoavailableseparately,catalog#80026-1.
Forresearchuseonly. Notforhumanordiagnosticuse.
ebiomall.com
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红细胞压积，是指红细胞占血液体积的比例，您仅仅是比参考范围略低，同时红细胞数量，和血红蛋白并没有下降，这可能是血液有所稀释所致。
白细胞计数3.9，正常的话 4-10之间，你仅仅是比参考范围略下降一丁点，本身并无意义，参考范围是大致的。而且血液还可能存在稀释可能性
中性粒细胞绝对值和百分比略低一点，同时淋巴细胞百分比略有上升，那这本身就只是略高一点点，而一般比如感冒以后，也往往可以升高，其他的红细胞分布宽度等是派生指标，没大意义的。
总之单单看这一个血常规检验，本身没有什么大的异常发现，当然也可以稍后复查，比如过2周以后复查
我是厉清，更多医疗知识，请看 厉清就是我 的新浪博客
G418浓度之前师兄已经摸索出来，这次筛选直接用师兄浓度。
1、6孔板转染后多长时间开始进行G418筛选？
2、G418筛选是在6孔板中继续筛选还是转到24/96孔？大皿？
3、G418浓度什么时候减量
4、？筛选过程中荧光观察一小部分克隆不错，如何挑选出来？
5、整个筛选过程大约需要多长时间？
lipo3000筛选
谢谢大家！
2：红细胞计数（RBC）（参考值：3.5~5.5），（单位：10^12/L）
3：血红蛋白浓度（HB）（参考值：120~160），（单位：g/L）
4：红细胞压积（HCT）（参考值：40~48），（单位：%）
5：平均红细胞体积（MCV）（参考值：80~97），（单位：fL）
6：平均红细胞血红蛋白含量（MCH）（参考值：26.5~33.5），（单位：pg）
7：平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）（参考值：300~360），（单位：g/L）
8：血小板计数（PLT）（参考值：100~300），（单位：10^9/L）
9：淋巴细胞比值（LY%）（参考值：17~48），（单位：%）
10：单核细胞比例（MONO%）（参考值：4-10），（单位：%）
11：中性粒细胞比例（NEUT%）（参考值：43~76），（单位：%）
12：淋巴细胞计数（LY）（参考值：0.8~4.0），（单位： 10^9/L）
13：单核细胞计数（MONO）（参考值：0.3~0.8），（单位：10^9/L）
14：中性粒细胞计数（NEUT）（参考值：1.2~6.8），（单位：10^9/L）
15：红细胞分布宽度（参考值：11~14.5），（单位：%）
16：血小板体积分布宽度（PDW）（参考值：9~18），（单位：%）
17：平均血小板体积（MPV）（参考值：7．4~12．5），（单位：fL）
18：大血小板比例（P-LCR）（参考值：10~50），（单位：%）
看到之前的一个朋友也发了IBC会议的PPT内容，不过好像没有这个PPT（不确定，要是重复了请见谅）。
因为会议上投影的问题，当时有些内容贾老师没介绍太多。不过内容相当不错，主要是国内比较缺乏这方面的信息和经验。可以算得上是干货吧，不过里面主要是一些规则性或方向性的内容，需要具体细节，只能花钱请她做顾问了。
AudreyJia是美籍华人，在FDA做CMCReviewer之前也一直是从事细胞开发及细胞培养的工作。她应该也是目前唯一一个生物大分子部门中，唯一从FDA离职出来从事顾问工作的。可能很多国内单抗药企大佬都认识她，可能很多园子里面的人也见过她了。
谁能赏几个积分啊？新人，没积分，一些东西想看或者下载都不行。
版主jackieustc留言:
感谢分享，鼓励新人，我给你打赏，多交流自然有收获！
Monoclonality_JIA1.pdf(952.57k)
各位，最近几个月一直在帮着公司进口细胞株，我是新手，从来没有接触过这样的业务，摸着石头过河，遇到了很多问题，也得到了很多教训和经验，不敢独享，觉得还是分享一下吧，给有需要的指指道，希望能少走弯路。
先不多说，正文如下：
大家看好了，我写的是企业进口细胞株，不是针对高校或者别的什么科研机构，因为到目前为止国家还没有一个正式的文件去指导企业进口细胞株，只有一个过渡性文件，因此各地操作时也有些不同，除了北京、上海、广东等一些发达的地方有操作程序，其他地方由于企业进口细胞株的案例很少，因此很麻烦的（比如黑龙江，我们最后都找到省卫生厅厅长了）。
首先，你们公司如果选择购买一个国外的细胞株，最先考虑的是付款问题，你得找一家进出口代理公司，帮你操作，这个都是比较常规的，另外你最好再找一家在北京或者上海的公司帮助清关。这里有涉及到“进口代理协议”和“供货合同，我们当时是签了一个三方合同”，这里一定要注意和国外沟通好，需要进口的细胞株的名称、数量、价值等等，后期发货的时候千万不要不一致。
因为细胞株是特殊物品，需要从省卫生厅那里拿到一个“医用特殊物品准出入境证明”，这个东西很难搞的（高校或科研机构容易一些，基本上都有程序），尤其是一些没有先例的省份（领导不敢批，怕担事），我们公司就是黑龙江的先例，这个东西不知道怎么办的到时候可以找我私聊。搞这个东西的正常周期是2-3周，请注意，一定要把准出入境的有效时间尽量写长一点，还有就是主送单位一定要你所清关的口岸的检疫局，例如北京口岸入境，就写北京出入境检验检疫局。当时没人提醒我，这两个我都搞错过，结果多跑了几次，我们的国家服务人员态度一次比一次差，快气死了，不过后来还是搞到了。
拿到“医用特殊物品准出入境证明”以后，预付款也打了，国外准备要发货了，这之前还要一个“特殊物品入境审批单”，这个需要到你所清关的口岸的检疫局搞，下面以北京出入境检验检疫局为例，这个东西要是你是外地的（非清关所在口岸）是搞不到的，你得先去北京出入境检验检疫局备案（就是公司证照原件，情况说明，单位说明等等，比较好办），然后在你细胞株进口之前2-3周申请（1周能批，有效期3个月）。我当时是委托北京一家公司办的，因为你自己办是不方便的，到时候审批单还要亲自去取，外地的很麻烦。
箱单、发票就不说了
接下来是运输，细胞株一般都用干冰运输，当然也可以选择液氮，不过价钱不一样，液氮要比干冰贵40%左右。要计算好运输过程中干冰损失量，量要足够，最好放一个温度记录仪，如果你没有把握，在货物到港清关之前，也可以加干冰的，就比较贵，单次1000元左右。发货之前一定和发货方、运输公司沟通好，标签和数量一定要准入证明和审批单一致，要不然清关很麻烦的，我再次犯了一个错误。
最后就是清关了，这里一定要注意，你找的清关公司的清关能力一定强，一定是做过冷链清关的。
总结一下：
程序是：签合同，找进口代理和清关公司，办理相关证明文件，选择冷了运输公司，运输，清关。
文件：合同、代理协议、医用特殊物品准出入境证明、特殊物品入境审批单、发票、箱单等。
另外，这里面还有不少细节，我就不一一说了，如果真有这方面运输的，可以找我。
版主horizon801留言:
谢谢分享
指导意见：
毕竟阴道上皮是鳞状上皮,而输尿管,膀胱,尿道的上皮是柱状上皮,形态上是不一样的.所以您要是对您的结果出怀疑态度,首先：重新留尿,做一个复检（留尿时注意防止阴道分泌物污染）；或者让值班医生分析一下是那种类型的上皮（鳞状还是柱状）.所以不要担心这个结果.一般情况下污染的比较多.
