Description:
HIFResponsiveLuciferaseReporterNIH/3T3StableCellLineisderivedfrommousefibroblast,andstablyexpressfireflyluciferasereportergeneunderthecontroloftheHIFresponseelement. ThiscelllineisanidealcellularmodelformonitoringtheactivationofHypoxiaReceptorSignalingPathwaytriggeredbystimulitreatment,enforcedgeneexpressionandgeneknockdown.Principle:
Hypoxia-InducIBLeFactor(HIF)-1isadimericproteincomplexthatplaysacentralroleintheresponsetolowoxygenconcentrations,orhypoxia,and isacrucialphysiologicalregulatorofhomeostasis,vascularization,andanaerobicmetabolism.HIFisatranscriptionfactorregulatinggeneexpressionbybindingtotheirDNArecognitionsiteonthetargetgenes.FurThermore,HIF-1hasbeenwidelystudiedbecauseofitsperceivedtherapeuticpotential. HIF-1allowssurvivalandproliferationofcancerouscellsduetoitsangiogenicproperties,andtheinhibitionpotentiallycouldpreventthespreadofcancer.WithagrowingunderstandingoftheHIF-1pathway,ithasbecomeanattractivegoaltoanalyzetheinhibitionandstimulationofHIFtranscriptionalactivityviasmallmolecules.
Thecelllinewasestablishedbytransfection usinga pTA-HIF-luciferasereportervector,whichcontains4repeatsofHIFbindingsites,aminimalpromoterupstreamofthefireflyluciferasecodingregion, alongwithhygromycinexpressionvectorfollowedbyhygromycinselection. ThehygromycinresistantclonesweresubsequentlyscreenedforCoCl2-inducedluciferaseactivity.
PrinciplebehindTFluciferasereporter. TFluciferasereporterstablecelllineutilizesartificialpromoterconstructstodriveluciferaseexpression. Thepromoterregioncanconsistsofmultiplerepeatsofacis-elementTFbindingsite,aDNAfragmentfromthepromoterregionofaknownTFdownstreamgene,oraDNAfragmentcontainingputative/knownTFbindingsites. ThereareseveralwaysthataTFcanbeactivated,suchasthroughextracellularstimuliorthroughintracellularsignalingpathways. Onceactivated,theTFtranslocatestothenucleusandofteninteractswithrelevantco-factorstodrivegeneexpression. Onceluciferaseisexpressed,itcangeneratelightinanenzymaticassayandtheamountoflightmeasuredispositivelycorrelatedwiththelevelofTFactivation. |
Data:
HIFNIH3T3StableCellLineAnalysis. HIFNIH3T3stablecellswereseededina96-wellcultureplatewiththeindicatedmedium. Thecellsweretreatedwith100uMCoCl2for8hours.
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1.将外源基因插入慢病毒载体
2.将构建完成的载体与慢病毒包装质粒混合，共转染靶细胞
3.收集病毒液
4.用病毒液感染靶细胞
5.用载体上带的抗生素进行筛选，如果没有，可以用无限稀释法
6.获得稳转株
由于质粒的不兼容性,拥有同种复制子的质粒不能在同一细胞内稳定共存,经过几代的复制,会质粒丢失,所以并不是任何两个或两个以上质粒都可以在同一细胞内稳定存在,但是可以同时进入.
稳定转染的细胞株，就是转染后质粒可以稳定整合到基因组上不会因细胞分裂而丢失。区别于质粒瞬时转染不能长时间保留质粒在细胞里。
对于瞬时转染的检测：如果有报告基因，就通过报告基因的表达看转染成功与否；没有报告基因的话，就在24～96h内收获细胞通过RT-PCR和WB来鉴定。
至于到底好不好转就跟你的细胞有关了，和细胞是否是稳转株关系不大。
① 在构建载体时，目的基因直接整合到细胞染色体组上，最好不要通过先瞬转在筛选稳定细胞株的这种方法，因为转染效率没有保证
② 高表达载体的构建，哺乳动物表达量一直是它自身的缺点，最好根据高表达载体定向的驯化细胞，提高蛋白表达量
③ 细胞的选择，筛选稳定细胞株我们常用的细胞是CHO，中国仓鼠卵巢细胞，由于CHO具有诸多的优点因此适合用于筛选稳定细胞株，而HEK293细胞则常用于瞬时转染
④ 后期的筛选，双抗预防污染，筛选细胞的时候抗生素浓度一定要做预实验，而且转染的时候不能有抗生素，关于细胞转染 稳定细胞系构建的相关理论
推荐了解“主细胞库”“工作细胞库”这两个名词。
建立稳定细胞株,一般是根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物对靶...专注整体实验·服务生命科学已开展了数千个实验外包项目
