【求助】293细胞培养后取上清做ELISA怎么取？

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2021-08-01

问题描述：

本人目前培养293T细胞中，两组细胞采用不同的抑制因子干预后共培养，然后取上清检测细胞因子的浓度，但是试剂盒尚未到达，由于是新手，用的6cm培养皿，一组两个皿练手，细胞长太快，我就经常把细胞消化后加培养基吹匀然后打掉一半，这样细胞就没那么快了，目前担心细胞老是传代是否会影响检测结果？另外该贴壁细胞上清液是要转板到培养板后直接收取吧，那么种板的细胞数是有没有特别要求？选择1-3x10^5/ml是否可以？ELISA搜集上清的量怎么把握？
感谢感谢，快过年了，没时间做实验了啊，试剂都还没到，希望能毕业。。。

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ruirui1988

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我的试剂盒说明书上样本只要100ul

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ruirui1988

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可以将上清冻存，有试剂盒之后再做

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佐至夏

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师姐说会影响实验数据，直接冻存细胞相对稳定些，我想问转板时细胞计数是否没有特别要求？1-3X10^5/ml均可吧

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Jimmy0909

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看你的试剂盒什么时候能到，如果时间长建议你先别做了，冻存细胞，到时培养起来很容易的，293T生长速度很快。或者传代时把细胞密度降低些，你现在是对半稀释，其实如果皿已长满的话，1:100甚至1:1000稀释都可以，可以减少传代次数减少浪费。是检测分泌至细胞外的细胞因子？这个量一般会很低。如果上清经ELISA直接检测不出来，可以收集上清经透析浓缩后再检测。

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佐至夏

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佐至夏

用户

展开引用Jimmy0909看你的试剂盒什么时候能到，如果时间长建议你先别做了，冻存细胞，到时培养起来很容易的，293T生长速度很快。或者传代时把细胞密度降低些，你现在是对半稀释，其实如果皿已长满的话，1:100甚至1:1000稀释都可以，可以减少传代次数减少浪费。是检测分泌至细胞外的细胞因子？这个量一般会很低。如果上清经ELISA直接检测不出来，可以收集上清经透析浓缩后再检测。......问你个问题，我大概冻存几个冻存管的细胞才能够重复3孔白介素-17ELISA检测的量？总共有四组，我转24孔板的时候每组种四个孔那么上清液是否就够检测的量了呢？估计是常识，师兄师姐这几年都没做细胞培养谢谢谢谢

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Jimmy0909

用户

佐至夏问你个问题，我大概冻存几个冻存管的细胞才能够重复3孔白介素-17ELISA检测的量？总共有四组，我转24孔板的时候每组种四个孔那么上清液是否就够检测的量了呢？估计是常识，师兄师姐这几年都没做细胞培养谢谢谢谢这还真没法回答了，我不知道你的293T细胞表达IL-17的量多大，怎么告诉你需要多少细胞呢？不过我前面就跟你说了，一般细胞分泌型表达的蛋白量都比较小，可能在ng/ml级别，甚至更低，24孔板一孔加得多也就0.6-1ml，取100ul，你的ELISA试剂盒灵敏度够不够？建议你做下预实验，用一小皿细胞（密度90%）上清，取100ul看你的ELISA试剂盒能否检测到，如果检测不到，将3ml上清浓缩成300ul（10倍），再测下试试。如果小皿细胞直接检测就能进入试剂盒的线性检测范围，那你用24孔板取出上清浓缩5倍检测就在线性范围内。如果小皿直接检测不到，那你就别用24孔板了，你可能需要换10cm大皿，而且上清要经过浓缩才能检测到。浓缩的方法比较好的有透析袋法，超滤法，实在不行就用TCA法沉淀所有蛋白。

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佐至夏

用户

展开引用Jimmy0909这还真没法回答了，我不知道你的293T细胞表达IL-17的量多大，怎么告诉你需要多少细胞呢？不过我前面就跟你说了，一般细胞分泌型表达的蛋白量都比较小，可能在ng/ml级别，甚至更低，24孔板一孔加得多也就0.6-1ml，取100ul，你的ELISA试剂盒灵敏度够不够？建议你做下预实验，用一小皿细胞（密度90%）上清，取100ul看你的ELISA试剂盒能否检测到，如果检测不到，将3ml上清浓缩成300ul（10倍），再测下试试。如果小皿细胞直接检测就能进入试剂盒的线性检测范围，那你用24孔板取出上清浓缩5倍检测就在线性范围内。如果小皿直接检测不到，那你就别用24孔板了，你可能需要换10cm大皿，而且上清要经过浓缩才能检测到。浓缩的方法比较好的有透析袋法，超滤法，实在不行就用TCA法沉淀所有蛋白。......好的，万分感谢！

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猪兔子一号

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请教一下怎么浓缩？

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