求助大神们：抗凝外周血离心取血浆后，所剩沉淀如何正确提取白细胞并冻存？
2021-07-26
问题描述：
各位大神们，我的课题实验需要提取临床患者抗凝外周血的血浆进行冻存和后续研究，由于血样珍贵，老板让我把离心提取血浆之后所剩的沉淀也加以利用，从剩下的沉淀（血细胞）当中提取出白细胞并冻存，用于之后做western。我用自己的外周血标本试做了一下，5mlEDTA抗凝外周血，3000rpm4℃离心10min后，取上层血浆分装-80冻存用于相关ELAISA实验，然后在下层沉淀（血细胞）中加入3倍体积的溶血剂，静置10min使红细胞裂解之后离心，结果并没有明显的分层，我重复了加溶血剂裂解红细胞并离心的步骤，到最后的结果还是只能达到如图所示。可以看到一层灰白色物质，但无法完全分离提取白细胞，所以想请教各位大神：①我的操作中有哪些错误烦请大家指出；②我用的溶血剂是OptilyseC的溶血剂，是否是试剂的问题？是否需要购买专门的红细胞裂解液，或者自行配制？③为什么裂解红细胞之后分层并不明显，多次离心之后还是分不清楚？④如果可以提取出白细胞，是否可以直接加入冻存液将白细胞-80℃冻存用于之后的研究（主要是Western，不影响细胞内蛋白即可）？因为是第一次做实验，血样珍贵，这种处理方法做过的人也很少，烦请有经验的各位批评指正，向大家虚心请教学习，不胜感激！
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明染
用户
1.10倍体积红细胞裂解液室温孵育10min，1500-2000转离心（最好是水平离心机，尽量减少细胞丢失）。一次裂不干净，再裂一次，有些标本就是特别难裂红。裂红过程中不会分层，用分离液提取单个核细胞才会有明显分层。2.可以冻存，我们是用血清+DMSO来冻存。
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Trrrrrrouble
用户明染1.10倍体积红细胞裂解液室温孵育10min，1500-2000转离心（最好是水平离心机，尽量减少细胞丢失）。一次裂不干净，再裂一次，有些标本就是特别难裂红。裂红过程中不会分层，用分离液提取单个核细胞才会有明显分层。2.可以冻存，我们是用血清+DMSO来冻存。非常感谢您的解惑！
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