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来自 : 蚂蚁淘
SolubilizationandrenaturationofproteinsfrominclusionbodiesMaterialsWashbuffer| 50mMTris-HClpH7.5 50-200mMNaCl Extractionbuffer | 50mMTris-HClpH7.5 8Murea 1mMDTT 1mMPMSF* | * | PMSFisinstableinaqeoussolutionsandaddedtothebufferatthepointdescribedintheprotocol. |
Stocksolutions| 100mMPMSF(phenylmethylsulfonylfluoride)inisopropanol. |
Procedure| 1. | Centrifugethecelllysateat4°Cfor20minat30000g[16000rpmusingaSS-34rotor(Sorvall)]. | | 2. | ResUSPendthepelletin10mlwashbuffercontaining1%TritonX-10and1Mureapergramcellwetweight.Incubateatroomtemperaturefor5min. | | 3. | Centrifugethecelllysateat4°Cfor20minat30000g[16000rpmusinganSS-34rotor(Sorvall)]. | | 4. | Repeatstep3twice. | | 5. | Resuspendthepelletin10mlwashbufferandcentrifugethesuspensionat4°Cfor30minat45000rpmusinga45Tirotor(Beckman). | | 6. | Resuspendtheinclusionbodiesinextractionbuffer.Usesomuchbufferthatthefinalproteinconcentrationinthesolutionis1mg/ml.- Add10µlPMSF(100mM)permlofsolutionatthispoint.
Incubatethesolutionatroomtemperaturefor60min. | | 7. | Dilutethesolutiontenfoldwithextractionbuffer(finalproteinconcentrationis0.1mg/ml)anddialyzeovernightagainsta100foldvolumeofwashbuffer. | | 8. | Centrifugethedialysateat4°Cfor30minat45000rpmusinga45Tirotor(Beckman). |
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