Type:ChickenIgY
Applications:ICC;IF;IHC;WB
E=ELISA;FACS;FC=FlowCytometry;FPLC=FastProteinLiquidChromatography;GF=GravityFlow;HPLC=HighPerformanceLiquidChromatography;ICC=Immunocytochemistry;IF=Immunofluorescence;IHC=Immunohistochemistry;IP=Immunoprecipitation;NAC=Non-adherentCellAssays;NB=NeutralizationofBioactivity;SE=SandwichELISA;TPE=TargetedProteinExpression;WB=Westernblotting;;AC=AdherentCellAssays;FM=FluorescentMicsroscopy;;;BSC-CM5=BiacoreSensorChipCM5;BSM=BiosactiveSmallMoleculeorPeptide;CDM=CellDifferentiationMedia;;;;;;HealthandFitness;;;DNAExtraction/Purification;;InvivoLikeAssaysSpeciesReactivity:Mammalian
B=Bovine;Ca=Cat;Ch=Chicken;D=Dog;EQ=Equine;GP=GuineaPig;H=Human;M=Mouse;P=Porcine;Pr=Primate;R=Rat;Rb=Rabbit;Y=Yeast;Xe=Xenopus;Ze=Zebrafish;;;;NA-NotApplicable;STP=Step-TactinProteins;AllFormat:AffinityPurified-liquid

mCherryisderivedfromproteinsoriginallyisolatedfromCnidarians(jellyfish,seaanemonesandcorals),andisusedasafluorescenttracerintransfectionandtransgenicexperiments.TheprototypeforthesefluorescentproteinsisGreenFluorescentProtein(GFP),whichisa~27kDaproteinisolatedoriginallyfromthejellyfish Aequoriavictoria.ThemCherryproteinisderivedfromDsRed,aredfluorescentproteinrelatedtoGFPisolatedfromso-calleddisccoralsofthegenusDiscosoma. DsRedissimilarinsizeandpropertiestoGFP,but,obviously,producesaredratherthanagreenFluorochrome.
Image:HeK293cellstransfectedinthesamewayandviewedintheconfocalmicroscope.MostHek293cellsarenottransfectedsoonlythenucleusofthesecellscanbevisualizedwithablueDNAstain.CellswhicharetransfectedwithCherryarebrightred.StainingwithCH22115isshowninGreen.GreenantibodystainingisonlyseencellswhichexpressCherry,asexpected,andthesuperimpositionofthegreenandredresultsinanorangesignal.InterestinglystrongerCherrystainingisseeninthenucleus,possIBLyduetodegradationofsomeCherrymoleculestoreleasethelowmolecularweightCherryfluorochrome.
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目标蛋白对细胞有毒性,导致细胞死亡;
转染试剂以及DNA用量信息需要优化,否则对细胞具有伤害;
细胞贴壁转染之后没有正常换液。
建议:考虑对目标蛋白进行截短构建、尝试其他细胞系统;摸索转染试剂以及DNA用量信息,如果转染试剂毒性太大,可以考虑尝试义翘转染试剂sinofection;对转染后的细胞进行换液处理,如果细胞状态感觉不够理想,可以考虑添加一些血清来帮助细胞恢复健康。
以上所有分析、建议的前提是,细胞培养、无菌操作等等都没有问题。祝顺利,加油~
各位版友求助,
我使用Hek293构建转染模型,瞬转5质粒,用lipo2000做转染体系。
转染48h,发现荧光较强的细胞都在爬片的边缘,比例十分少。是因为我添加试剂的手法不对吗。
同时也发现加入转染体系后细胞状态特别差。想问一下用lipo2000时可以用无双抗的10%FBSDMEM吗。我转染前6h现在用的是纯DMEM,不含FBS。
请各位大神帮忙
我刚开始做转染,悬浮细胞,分别做过表达和敲减,看了很多文献,大都没有提及转染后是用转染的这同一批细胞同时做pcr,wb,cck8,凋亡,细胞周期;还是说这次转染只做pcr或wb,再转染一次做cck8或细胞周期。剩下的功能试验均同前,转染一次做一次?我养的是悬浮细胞,转染后做cck8这些功能试验前需要离心换液吗?跪谢解答!
DXY721认为:
悬浮细胞和贴壁细胞在转染过程中差别不大,主要差别在于转染后的筛选,当然如果你做的是瞬时转染就不存在筛选的问题了。
其实转染的过程很简单,问题是能不能转的进去的,转染率能有多少,转进去是否可以稳定表达目的蛋白等等。
我们也是用脂质体做悬浮细胞的转染,说明书上都有具体的操作过程,将脂质体和目的基因按比例混合,然后加到细胞悬液里就OK了,说的简单,实际上还是有一些细节要注意的,比如脂质体和目的基因混合的比例,转染的细胞数,细胞的代数,细胞的状态,有的还要求在转染的前一天传代一次,不过不要怕,这些在脂质体说明书上都有明确的说明,按照说明书做就可以了。
jinghuanlv认为:
悬浮细胞和贴壁细胞转染还是有很大不同的。
脂质体转染的原理基于电荷吸引原理,先形成脂质体-DNA复合物,散布在细胞周围,然后通过细胞的内吞作用,将目的基因导入细胞内,而脂质体复合物与贴壁细胞的接触机会比悬浮细胞高出很多倍,所以,脂质体转染时悬浮细胞的转染效率要明显低于贴壁细胞。
我们实验室转染悬浮细胞是用的电穿孔法,目前为止,悬浮细胞转染的最好方法还是电转,我们实验室用的电转仪是Bio-Rad的,使用条件是电压250V,电容975uF,效果不错,不妨一用。
实验室一直都是用日常型质粒抽提试剂盒,转染细胞没问题。
我觉得只要是注意以下2点就可以了:
1,注意大肠杆菌(Escherichia coli)本身的污染,收集菌体沉淀时防止菌液散落,经常用75%的乙醇擦拭手套。
2,最后洗脱时最好使用无内毒素的水,我们是用注射用水的。
无论是小提还是大提我们都是用的日常型的,并没有刻意用转染级的,因为转染量大,去内毒素的操作太麻烦,损失太大。
做的比较好的,一般都是上海地区的,你可以看下基尔顿生物。
本人研究生

