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检测细胞凋亡的方法有哪些?
2017-10-02
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一、形态学观察方法  1、HE染色、光镜观察:凋亡细胞呈圆形,胞核深染,胞质浓缩,染色质成团块状,细胞表面有“出芽”现象。  2、丫啶橙(AO)染色,荧光显微镜观察:活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。  3、台盼蓝染色:如果细胞膜不完整、破裂,台盼蓝染料进入细胞,细胞变蓝,即为坏死。如果细胞膜完整,细胞不为台盼蓝染色,则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性,区别坏死细胞有一定的帮助。  4、透射电镜观察:可见凋亡细胞表面微绒毛消失,核染色质固缩、边集,常呈新月形,核膜皱褶,胞质紧实,细胞器集中,胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。  二、DNA凝胶电泳  (一)检测原理  细胞发生凋亡或坏死,其细胞DNA均发生断裂,细胞内小分子量DNA片断增加,高分子DNA减少,胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间,出现180-200bpDNA片断,而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断,利用此特征可以确定群体细胞的死亡,并可与坏死细胞区别。  (二)结果判断  正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状(LADDER)条带;坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。  三、酶联免疫吸附法(ELISA)核小体测定  凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成,可由ELISA法检测。  (一)检测步骤  1、将凋亡细胞裂解后高速离心,其上清液中含有核小体;  2、在微定量板上吸附组蛋白体;  3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合;  4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合;  5、加酶的底物,测光吸收制。  (二)用途  该法敏感性高,可检测5*100/ml凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器,适合基层工作,但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。  四、流式细胞仪分析  (一)检测原理  细胞发生凋亡时,其细胞膜的通透性也增加,但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用一特点,被检测细胞悬液用荧光素染色,利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。  (二)应用价值  流式细胞仪检测具有以下特点:  1)、检测的细胞数量大,因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确  2)、可以做许多相关性分析  3)、结合被检测细胞的DNA含量的分析,可确定凋亡的细胞所处的细胞周期  ■检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法  细胞发生凋亡时,其细胞膜的通透性液增加,但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间,利用这一特点,被检测细胞悬液用荧光素染色,利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。  利用Hoechs-PI染色法,正常细胞对染料有抗拒性,荧光染色很浅,凋亡细胞主要摄取Hoecha染料,呈现强蓝色荧光,而坏死细胞主要摄取碘化丙啶(PI)而呈强的红色荧光。  ■DNA片断原位标记法  凋亡细胞DNA片断原位末端检测技术是指在细胞(或组织)结构保持不变的情况下,用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸(deoxyuridinetriphate,DUTP)和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)相反应与凋亡细胞裂解后3.的羟基(-OH)端结合,经显色反应后检测DNA裂解点的技术。  DNA片段原位标记法有二种:  1、原位缺口转移(in situ nick-translation,ISNT)技术,它是利用DNA多聚酶I将标记的核苷酸连接到断裂DNA的3-OH端  2、原位缺口末端标记技术(in situ end labelling technique,ISEL),即TUNEL法,它是利用TdT将标记的DUPT接到3-OH端。研究证明,TUNEL法的敏感性远高于ISNT,尤其对早期凋亡的检测,TUNEL为合适。  ■检测细胞膜成分变化的Annexin V 联合PI法  1、原理:在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白V(Annexin V)是钙依赖性的磷脂结合蛋白,它于PS具有高度的结合力。因此,Annexin V可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。故利用对PS有高度亲和力的Annexin V,将Annexin V标记上荧光素(如异硫氰酸荧光素FITC),同时结合使用PI拒染法(因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测,且对PI高染)进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。  2、结果判断:正常活细胞Annexin V 、PI均低染;凋亡细胞Annexin V高染、PI低染;坏死细胞Annexin V/PI均高染。  3、应用价值:细胞发生凋亡时,膜上的PS外露早于DNA断裂发生,因此Annexin V联合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。又Annexin V联合PI染色不需固定细胞,可避免PI染色因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。因此,Annexin V联合PI法更加省时,结果更为可靠,是最为理想的检测细胞凋亡的方法。
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太阳蛙蛙
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几种检测凋亡的方法一、形态学观察方法1、HE染色、光镜观察:凋亡细胞呈圆形,胞核深染,胞质浓缩,染色质成团块状,细胞表面有“出芽”现象。2、丫啶橙(AO)染色,荧光显微镜观察:活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。3、台盼蓝染色:如果细胞膜不完整、破裂,台盼蓝染料进入细胞,细胞变蓝,即为坏死。如果细胞膜完整,细胞不为台盼蓝染色,则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性,区别坏死细胞有一定的帮助。4、透射电镜观察:可见凋亡细胞表面微绒毛消失,核染色质固缩、边集,常呈新月形,核膜皱褶,胞质紧实,细胞器集中,胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。二、DNA凝胶电泳(一)、检测原理细胞发生凋亡或坏死,其细胞DNA均发生断裂,细胞内小分子量DNA片断增加,高分子DNA减少,胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间,出现180-200bpDNA片断,而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断,利用此特征可以确定群体细胞的死亡,并可与坏死细胞区别。(二)结果判断正常活细胞DNA电泳出现阶梯状(LADDER)条带;坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。三、酶联免疫吸附法(ELISA)核小体测定凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成,可由ELISA法检测。(一)检测步骤1、将凋亡细胞裂解后高速离心,其上清液中含有核小体;2、在微定量板上吸附组蛋白体’3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’4、加酶的底物,测光吸收制。(二)用途该法敏感性高,可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器,适合基层工作,但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。四、流式细胞仪定量分析(一)检测原理细胞发生凋亡时,其细胞膜的通透性也增加,但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用这一特点,被检测细胞悬液用荧光素染色,利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。(二)应用价值流式细胞仪检测具有以下特点:1)、检测的细胞数量螅虼似浞从橙禾逑赴牡蛲鲎刺冉献既?BR>2)、可以做许多相关性分析3)、结合被检测细胞的DNA含量的分析,可确定凋亡的细胞所处的细胞周期■检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法细胞发生凋亡时,其细胞膜的通透性液增加,但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间,利用这一特点,被检测细胞悬液用荧光素染色,利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。利用Hoechs-PI染色法,正常细胞对染料有抗拒性,荧光染色很浅,凋亡细胞主要摄取Hoecha染料,呈现强蓝色荧光,而坏死细胞主要摄取碘化丙啶(PI)而呈强的红色荧光。■DNA片断原位标记法凋亡细胞DNA片断原位末端检测技术是指在细胞(或组织)结构保持不变的情况下,用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸(deoxyuridinetriphate,DUTP)和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)相反应与凋亡细胞裂解后3·的羟基(-OH)端结合,经显色反应后检测DNA裂解点的技术。DNA片段原位标记法有二种:1、原位缺口转移(insitunick-translation,ISNT)技术,它是利用DNA多聚酶I将标记的核苷酸连接到断裂DNA的3·-OH端2、原位缺口末端标记技术(insituendlabellingtechnique,ISEL),即TUNEL法,它是利用TdT将标记的DUPT接到3·-OH端。研究证明,TUNEL法的敏感性远高于ISNT,尤其对早期凋亡的检测,TUNEL更为合适。■检测细胞膜成分变化的AnnexinV联合PI法1、原理:在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白V(AnnexinV)是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白,它于PS具有高度的结合力。因此,AnnexinV可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。故利用对PS有高度亲和力的AnnexinV,将AnnexinV标记上荧光素(如异硫氰酸荧光素FITC),同时结合使用PI拒染法(因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测,且对PI高染)进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。2、结果判断:正常活细胞AnnexinV、PI均低染;凋亡细胞AnnexinV高染、PI低染;坏死细胞AnnexinV/PI均高染。3、应用价值:细胞发生凋亡时,膜上的PS外露早于DNA断裂发生,因此AnnexinV联合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。又AnnexinV联合PI染色不需固定细胞,可避免PI染色因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。因此,AnnexinV联合PI法更加省时,结果更为可靠,是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。◆几点参考1.大部分凋亡细胞可能并不见得有非常典型的凋亡表型,如电镜的染色体边集、凋亡小体等,DNA电泳也不见得都有DNAladder,但对某些指标来说还算稳定,如PI染色及TUNEL法,所以如果某个方法效果不好,可以换用其他方法检测2.坏死与凋亡的区分传统上认为是无序与有序的过程,楼上所说的线粒体肿大也是以前的一个传统认识,但现在有很多人认为坏死的发生也是有序发生的,因此也有了程序化坏死一说,在很大程度上,由于凋亡是时间依赖性的过程,细胞发生凋亡也并非同步化的,凋亡的晚期与坏死进行区分是困难的,而且我认为如果不是对于凋亡或是坏死本身通路进行研究的话,强行区分是没有意义的。展开
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