根据调亡形态学特征的检测方法

一、普通光学显微镜观察方法

1）苏木素－伊红染色（HE染色法）

石蜡组织切片的HE染色

1．取材组织块，经固定后，常规石蜡包埋，4μm切片。

2．切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯（I）5min→二甲苯（Ⅱ）5min→100％乙醇2min→95％的乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸馏水洗2min。

3．苏木素染色5min，自来水冲洗。

4．盐酸乙醇分化30s（提插数下）。

5．自来水浸泡15min或温水（约50℃）5min。

6．置伊红液2min。

7．常规脱水，透明，封片：95％乙醇（I）min→95％乙醇（Ⅱ）1min→100％乙醇（I）1min→100％乙醇（Ⅱ）1min→二甲苯石碳酸（3：1）1min→二甲苯（I）1min→二甲苯（Ⅱ）1min→中性树脂封固。

2）甲基绿－派诺宁染色法

1．新鲜取材组织固定液中4℃固定3～6小时。

2．直接转入95％乙醇脱水和无水乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。

3．切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化至蒸馏水。

4．置染色液中室温下染片约1h。

5．取出切片，不经水洗，用滤纸吸干多余染液。

6．插入丙酮中迅速分化。

7．转入丙酮二甲苯（1：1）稍洗。

8．二甲苯透明2～3次。

9．中性树胶封固。

3）Giemsa染色

1．收集细胞（1×10⁶），PBS洗1次。

2．用细胞涂片离心机制成细胞涂片。

3．甲醇固定3～5min。

4．入Giemsa稀释染色液15～30min，冬天在37℃温箱中染色。

5．用磷酸盐缓冲液分色，以镜下控制为准。

6．涂片晾干后用中性树胶封片。

4）瑞氏（Wright）染色

1．收集细胞（1×10⁶），PBS洗1次。

2．用细胞涂片离心机制成细胞涂片。

3．甲醇固定3～5min。

4．用Wright液染色2min。

5．入Wright磷酸缓冲液稀释液4～10min，然后用蒸馏水冲洗。此时如果颜色较深，可0.08％醋酸分化数秒钟。

6．直立晾干后，用中性树胶封固。

二、透射电子显微镜观察方法

1）透射电镜样本的取材和固定

培养细胞的取材和固定

1．常规收集帖壁和悬浮细胞，置离心管中离心，800～1000r/min，10min。

2．用0.01mol/LPBS5ml重悬细胞。

3．将细胞悬液吸入有琼脂空槽的离心管中。

4．离心，2000r/min，15～20min，使细胞成团。

5．小心吸去上清，加入2.5％戊二醛固定液固定细胞团，以免细胞团散开。

6．取出离心管内的琼脂，仔细切下尖槽内含有细胞团的琼脂块。

7．将含细胞的团琼脂块投入含戊二醛固定液的小瓶中，4℃（可长期）保存。

8．用0.1mol/LPBS缓冲液洗1次。

9．1％锇酸后固定30～60min。

三、荧光显微镜观察方法

1）吖啶橙染色法

1．制备活细胞悬液，浓度约为10⁷/ml。

2．取95μl的细胞悬液，加5μl的吖啶橙贮存液混匀。

3．吸一滴混合液点洁净玻片上，直接用盖玻片封片。

4．荧光显微镜选用激发滤片BG12或BV等，阻断滤片用515nm或SP3。

2）Hoechst33258染色法

1．原代细胞培养，细胞学涂片或细胞甩片机制备的单细胞片。

2．细胞固定液4℃固定5min。

3．蒸馏水稍洗后，点加Hoechst33258染色液，10min。

4．蒸馏水洗片后，用滤纸沾去多余液体。

5．封片剂封片后荧光显微镜观察。

3）Hoechst33342染色法

1．将Hoechst33342加入培养的细胞中，终浓度为10μg/ml37℃孵育30min。

2．4％的多聚甲醛和培养液以1：3混合，使多聚甲醛的浓度为1％，固定细胞5～10min。

3．固定好后，将细胞悬液涂在载玻片加盖玻片。

4．荧光显微镜激发滤片选用UV激发滤片，阻断滤片为400～500nm。

以上是先将细胞染色后再行固定观察的方法，也可先固定后染色：

1．收集（0.5～3.0）×10⁶个细胞，500～1000r/min，离心5min去上清。

2．PBS洗1次，500～1000r/min，离心5min去PBS。

3．用3％多聚甲醛50μl重悬细胞，室温下固定10min。

4．PBS洗1次，500～1000r/min离心5min去PBS。

5．用15μl的Hoechst33258或33342重悬细胞，终浓度为16μg/ml，孵育15min。

6．取10μl放在玻片上，荧光显微镜下观察，可数500个细胞，计算调亡率。