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请教各位前辈：流式细胞分析技术检测细胞周期和细胞凋亡的变化，是不是一般都是用AnnexinV-PI试剂的？据说这个比较贵是吗？有其他的可以代替吗？

主要是：细胞变圆,染色质凝聚、分块,胞质皱缩.之后整个细胞通过发芽、起泡等方式形成一些 球形的突起,并在其基部绞断而脱落形成大小不等的内含胞质、细胞器及核碎片的凋亡小体,然后被周围细胞所吞噬.
其他的特征是：1.由基因控制,2,不引起炎症.3.质膜不破裂,4,染色质DNA的有控裂

细胞凋亡最终是被吞噬细胞吞噬的，具体过程比较复杂，如下：
细胞凋亡首先出现的是细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，然后是细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞色素C到胞浆，核质浓缩，核膜核仁破碎，DNA降解成为约180bp-200bp片段；胞膜有小泡状形成，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，胞膜结构仍然完整，最终可将凋亡细胞遗骸分割包裹为几个凋亡小体，无内容物外溢，因此不引起周围的炎症反应，凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。

受环境影响；
凋亡虽是自主的但一般有外界因素刺激,致使信号传导,近而控制基因表达
生物性状是外界环境与基因共同决定的
比如，正常的杨树在北方到秋天会落叶,这是细胞凋亡,程序化的。但是，在南方，它不会在秋天凋亡.因此，细胞凋亡受环境影响。

一、形态学观察方法
　　1、HE染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。
　　2、丫啶橙（AO）染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。
　　3、台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。
　　4、透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。

　　二、DNA凝胶电泳
　　（一）检测原理
　　细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。

　　（二）结果判断
　　正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER）条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。

　　三、酶联免疫吸附法（ELISA）核小体测定
　　凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。

　　（一）检测步骤
　　1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体；
　　2、在微定量板上吸附组蛋白体；
　　3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合；
　　4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合；
　　5、加酶的底物，测光吸收制。

　　（二）用途
　　该法敏感性高，可检测5*100/ml凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，适合基层工作，但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。

　　四、流式细胞仪分析
　　（一）检测原理
　　细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。

　　（二）应用价值
　　流式细胞仪检测具有以下特点：
　　1）、检测的细胞数量大，因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确
　　2）、可以做许多相关性分析
　　3）、结合被检测细胞的DNA含量的分析，可确定凋亡的细胞所处的细胞周期

　　■检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法
　　细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性液增加，但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间，利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。
　　利用Hoechs-PI染色法，正常细胞对染料有抗拒性，荧光染色很浅，凋亡细胞主要摄取Hoecha染料，呈现强蓝色荧光，而坏死细胞主要摄取碘化丙啶（PI）而呈强的红色荧光。

　　■DNA片断原位标记法
　　凋亡细胞DNA片断原位末端检测技术是指在细胞（或组织）结构保持不变的情况下，用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate，DUTP）和末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）相反应与凋亡细胞裂解后3.的羟基（－OH）端结合，经显色反应后检测DNA裂解点的技术。

　　DNA片段原位标记法有二种：
　　1、原位缺口转移（in situ nick-translation，ISNT）技术，它是利用DNA多聚酶I将标记的核苷酸连接到断裂DNA的3－OH端
　　2、原位缺口末端标记技术（in situ end labelling technique，ISEL），即TUNEL法，它是利用TdT将标记的DUPT接到3－OH端。研究证明，TUNEL法的敏感性远高于ISNT，尤其对早期凋亡的检测，TUNEL为合适。

　　■检测细胞膜成分变化的Annexin V 联合PI法
　　1、原理：在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白V（Annexin V）是钙依赖性的磷脂结合蛋白，它于PS具有高度的结合力。因此，Annexin V可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。故利用对PS有高度亲和力的Annexin V，将Annexin V标记上荧光素（如异硫氰酸荧光素FITC），同时结合使用PI拒染法（因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测，且对PI高染）进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。

　　2、结果判断：正常活细胞Annexin V 、PI均低染；凋亡细胞Annexin V高染、PI低染；坏死细胞Annexin V/PI均高染。

　　3、应用价值：细胞发生凋亡时，膜上的PS外露早于DNA断裂发生，因此Annexin V联合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。又Annexin V联合PI染色不需固定细胞，可避免PI染色因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。因此，Annexin V联合PI法更加省时，结果更为可靠，是最为理想的检测细胞凋亡的方法。

本人细胞实验新手，现在在做细胞凋亡方面的实验，但是，对于得到的细胞凋亡的图有一些疑惑的地方。

这是空白双阴的图

这三个是我给不同药物得到的凋亡的图，每一个图在晚期凋亡的象限内都有这个横这个的一块区域的细胞，我不明白这块区域的细胞是怎么来的

这个是我圈门用的图

主要想问一下，那个横着的这块区域是怎么回事？还有凋亡用无EDTA的胰酶消化一般是在室温还是培养箱，消化多久？我今天消化了6min，依旧看不见有空白组细胞间隙的分开，但是我给药组的细胞已经有明显的皱缩了，所以我就赶紧收集了，发现空白组可以吹下来，这个消化是看间隙增大还是凭感觉？

细胞凋亡呈现出特征性形态学变化，主要包括细胞皱缩、染色质凝集、凋亡小体形成、细胞骨架解体等，其中以胞核的变化最为显著；细胞凋亡时细胞的生化改变具有复杂性和多样性，包括DNA片段化、多种蛋白酶控制、胞浆Ca2+持续升高、pH的变化、线粒体在细胞凋亡中起重要作用。

细胞凋亡的速率与它们的功能是有关系的。向左转|向右转
凋亡是多基因严格控制的过程。这些基因在种属之间非常保守，如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因如C-myc、抑癌基因P53等，随着分子生物学技术的发展对多种细胞凋亡的过程有了相当的认识，但是迄今为止凋亡过程确切机制尚不完全清楚。而凋亡过程的紊乱可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系。如肿瘤、自身免疫性疾病等，能够诱发细胞凋亡的因素很多，如射线、药物等。
其实从严格的词学意义上来说，细胞程序性死亡（PCD）与细胞凋亡是有很大区别的。细胞程序性死亡的概念是1956年提出的，PCD是个功能性概念，描述在一个多细胞生物体中某些细胞死亡是个体发育中的一个预定的，并受到严格程序控制的正常组成部分。例如蝌蚪变成青蛙，其变态过程中尾部的消失伴随大量细胞死亡，高等哺乳类动物指间蹼的消失、颚融合、视网膜发育以及免疫系统的正常发育都必须有细胞死亡的参与。这些形形色色的在机体发育过程中出现的细胞死亡有一个共同特征：即散在的、逐个地从正常组织中死亡和消失，机体无炎症反应，而且对整个机体的发育是有利和必须的。因此认为动物发育过程中存在的细胞程序性死亡是一个发育学概念，而细胞凋亡则是一个形态学的概念，描述一件有着一整套形态学特征的与坏死完全不同的细胞死亡形式。但是一般认为凋亡和程序性死亡两个概念可以交互使用，具有同等意义。细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用。它在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型，而且具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制。

请问一下大家，如果想做流式细胞仪检测细胞凋亡情况，请问细胞应该接种在多大的孔板上

最近在用流式测加药后细胞凋亡情况，但加的药物是自发红光的柔红霉素，用常用的凋亡试剂盒，annexinV-fitc和PI双染的测流式，干扰比较大，想问问有人遇到过类似情况吗？请教一下有没有什么解决方法。

做CCK8很多次了，每次96孔板五个梯度的药物浓度OD值波动很大，同一块板子不同时间1.2.3.4h趋势都不同，浓度梯度和结果很乱，很是困惑，MTT做出一次，这个是6个复孔取平均值做的趋势图，五个点从左到右是由高浓度到低浓度，希望大神帮忙，

细胞凋亡是细胞程序化死亡的一种，是指细胞在凋亡因子刺激下发生的受基因调控的细胞自杀性行为。本文威正翔禹/缔一生物为您分析什么是细胞凋亡？它与细胞坏死有什么区别？

细胞凋亡存在于正常生理情况下，是在个体发育、多细胞生物体平衡和疾病发生中起重要作用的一种细胞死亡形式。细胞凋亡有别于细胞死亡的另一种方式——细胞坏死(necrosis)。

细胞坏死与细胞凋亡的区别首先在于外观形态上变化不同，坏死的细胞表现为体积胀大，细胞膜失去了完整性，易被染料（如台盼蓝）所透过;而凋亡的细胞则表现为细胞体积变小。

细胞凋亡是一个受基因严密调控的生物过程，而细胞坏死则通常是偶然因素，如受热和药物损伤等引起溶酶体的颗粒内容物释放失控引起;坏死细胞会引发炎症初期的免疫反应，而凋亡细胞在通常情况下并不诱导抗炎症反应。然而，细胞坏死和细胞凋亡的区别也不是绝对的，同一种诱导因素（如局部缺血、H202)可能引发凋亡或坏死，取决于诱导因素的强弱和损伤的严重性。

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