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Spacechem这东西怎麼玩...【steam吧】_
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NitrogenBomb1)Harvestcellsandwash2timeswithPBS.2)ResUSPendfinalpelletinrelaxationbuffer.(20ml/1X109cells)3)PressurizewithN2for20minutesat350psi,40Cwithconstantstirringinanitrogenbomb.4)CollectcavitatedropwiseintoEGTA,pH7.4.-->ThefinalEGTAconcentrationshouldbe1.25mM.Fractionation5)Pelletthenucleiandunbrokencellsbycentrifugingthecavitateat500g,40Cfor10min.-->ThispelletisknownastheP1fraction.6)Thesupernatantshouldbedecantedandlayeredontoaprecooled(to40C)PercollgrADIent.


ReagentsRelaxationbuffer(withoutEGTA):100mMKCl3mMNaCl1mMATP(Na)23.5mMMgCl210mMPIPESpH7.3


NOTERelaxationbuffer,ahigh-potassium,low-sodium,calcium-freebuffercontainingMgATP,wasdesignedtomimiccytoplasmicconditionsintheneutrophil,basedinpartuponconditionsshowntopromotecytoplasmiocrelaxationinnonmusclecontractilesystems.


ReferenceBorregaard,N.etal.(1983)J.CellBiol.97,52-61.

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