基本原理NK细胞克隆来源于NK细胞，该细胞的分离方法参见第一节之四。这些NK细胞与经γ射线照射的饲养细胞苓而获得的NK细胞克隆。试剂和材料●植物血凝素（PHA）母液为100μg/ml●重组IL－2（rIL－2）母液为105u/ml，分装小瓶（0．5ml/瓶），置－20℃长期保存，或置4℃下短期存放。应避免反复冻融，IL－2不能用滤器过滤除菌处理。●培养基1.接种培养液：RPMI1640＋10％FCS＋0．5μg/mlPHA＋200u/mlIL－2＋10g/L谷氨酰胺＋100u/ml青霉素＋100μg/ml链霉素＋1mmol/L丙酮酸钠。2.饲养细胞培养液：RPMI1640＋10％FCS＋10g/L谷氨酰胺＋100u/ml青霉素＋100μg/ml链霉素＋1mmol/L丙酮酸钠。3.NK克隆培养液：RPMI1640＋10％FCS＋10g/L谷氨酰胺＋100u/ml青霉素＋100μg/ml链霉素＋1mmol/L丙酮酸钠，经0．2u滤板过滤再加入100u/mlIL－2。4.培养液：RPMI1640＋10％FCS。●饲养细胞：自体或同种异体PBMC●器皿和仪器：96孔细胞培养板、多头移液管、微量移液管、倒置显微镜、CO₂孵箱、低温离心机、垂直气流超净台实验操作1.NK细胞的制备1）制备NK的方法参见第一章之第四节。2）悬浮NK于接种培养液中，细胞浓度调至106/ml。2.接种NK细胞1）制备饲养细胞（PBMC）方法参见第一章第一节。2）于4℃用300×g离心饲养细胞12min。3）被离心的饲养细胞悬浮于饲养培养液中，细胞浓度调至2×106/ml。4）用强度5000radγ射线照射饲养细胞，于4℃用300×g离心饲养细胞12min，将离心细胞再悬浮于饲养细胞培养液中，饲养细胞浓度调至2×10⁶/ml。5）在6块96孔培养板的各孔中加100μl上述饲养细胞悬液（总量用60ml饲养细胞悬液，含1．2×10⁸个饲养细胞）。6）将96孔板置37℃孵箱预温，直到加入NK细胞。7）将NK细胞悬浮于接种培养液中，并于预温的96孔板中加入100μlNK细胞，使成为10细胞/孔、5细胞/孔和2．5细胞/孔的三种类型板，而且每种类型重复二块板。8）将培养板置5％CO₂孵箱中37℃培养。3.NK细胞的再刺激（接种后2－3天，主要依赖于饲养细胞）1）从每孔中轻轻移弃100μl上清液。2）每孔中加入含有经照射的饲养细胞（2×10⁶细胞/ml）的NK克隆培养液100μl。此培养液的制备方法如下：（1）融化饲养细胞，移至50ml试管中。（2）轻轻地加入培养液30ml，混匀后用5000radγ射线照射饲养细胞。（3）用300×g离心饲养细胞12min，并计数饲养细胞数量。（4）按细胞计数结果，将饲养细胞悬浮于NK克隆培养液中，调至细胞浓度为2×10⁶/ml。4.换液（6－8天）从每孔中轻轻移弃100μl上清液，并加入新鲜NK克隆培养液100μl。5.检测NK细胞的生长状况（9－10天）如检查有细胞生长，按第8天的操作换液。6.分离克隆（11－15天）1）当培养液颜色变黄时，证明细胞已生长，在96孔板上将生长的NK按1孔分为2孔，2孔分为4孔，4孔分为8孔的方式分离克隆培养。2）在96孔板上扩增克隆，并重复第7天的操作。质控与提示1.每天需检查细胞生长情况。2.NK细胞克隆只生长在96孔板上，NK细胞总是用96孔培养板进行克隆培养。3.目前了解，鼠NK细胞克隆的制备仅限于短期培养。