蛋白质双向电泳过程与体会双向电泳IEF(sigma)IEF（notIPG）/SDS-PAGE最简单的装备推荐如下，适合于没多少money做IPG又想做“热”的所谓蛋白质组的，嘻嘻！IEF用Biorad的圆盘电泳槽（不行用国产的吧，不推荐），SDS-PAGE用六一厂的就可以了（ft，六一厂应该给我money吧，给你做广告了)(money不是很多的强烈推荐六一的，买进口电泳槽的钱留出来测搞出的差异蛋白质的序列吧，呵呵）BIO－RAD的圆盘电泳槽，国产的不推荐，因为上槽Biorad的铂金丝凹进去了一点，不是很进去，而国产的凹得太进去了以至于电聚焦时产生的气泡绕在铂金丝一圈，影响电聚焦。双向电泳蛋白质样品制备秧苗蛋白质样品的提取按Davermal等（1986）的方法进行。100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5ml10%三氯乙酸（丙酮配制，含10mM即0.07%β-巯基乙醇），混匀，-20℃沉淀1小时，4℃，15000r/min离心15min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10mMβ-巯基乙醇)，再于-20℃沉淀1小时，同上离心弃上清，（有必要再用80％丙酮(含10mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。按每mg干粉加入20μl（可调）UKS液[9.5M尿素，5mM碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫苏糖醇)，2%Ampholine(AmershamPharmaciaBiotechInc，pH3.5-10)，6%TritonX-100]，37℃育30min，期间搅动几次，28度（温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰）16000r/min离心15min，离心力越大时间长一点越好！上清即可上样电泳。或者-70度保存2蛋白质浓度测定按Garrels（1983）的程序，稍加改动。10μl上述用UKS液制得的蛋白质样品中加入40μl水及50μl20%三氯乙酸，冰浴30min后，4℃，4000r/min离心15min，弃上清，再加入100μl冷丙酮，同上离心5min，弃上清，冻干沉淀，用100μlPBS溶液复溶，并按Bradford（1976）的程序测定蛋白质浓度。说实话，好象Bradford法不太好做2.3.1电聚焦（IEF）2.3.1.1玻管准备干净玻管(18cm×1.5mm)用Parafilm封口膜封好底部，在16cm处作好标记,垂直放在泡沫板上。电聚焦的管子，买原装的也可以，实在不行自己也可以做的，1ml的移液管，内径1.5mm左右的，长度取18cm，用玻璃刀做，呵呵，很容易的；玻璃管的处理，先用2M的NaOH泡至少1hr，用自来水冲后;用双蒸水冲，用双蒸水泡至少1hr，中间至少换2，3次水;后用2M的HCL泡至少1个小时，用双蒸水冲，（不能用自来水冲），然后双蒸水泡至少1个小时，中间换3，4次水，可多泡一会。最后泡在无水乙醇里面1hr，轰干就可以用了.2.3.1.2凝胶制备与电聚焦灌IEF的配方为3.09克尿素1.125ml10%NP-401.125ml水0.735ml30%屏息现案(ACR28.38BIS1.62)0.15mlAm3.5-100.375mlAm5-78卫生10%AP1.8卫生TEMED用注射器吸好胶液，装上7号针头，将7号针头插入玻管底部，边推注射器边提针头，直到标记处，用微量进样器小心加入少量水，可见明显的界面出现，让其聚合1小时以上，适当长一点的时间好一些，我一般是头天下午灌胶，第2天下午才开始跑电泳。待胶聚合好后，除去Parafilm并吸去顶部的覆盖液，加样80μg，上面再小心加入50mmol/LNaOH至管口,不要破坏样品与NaOH的界面。即可进行电泳。电极液为：上槽（负极）为50mmol/LNaOH液，下槽（正极）为25mmol/LH3PO4。按200V×15min，300V×30min，400V×18h，1000V×1h的程序进行电聚焦。或者直接400V17hr1000V2hrveryimportantthingis跑第一向一定要在保持在37度左右,特别是冬天,我的方法是温控仪控制暖风机在37度暖风机和电泳槽在一个大的纸箱(密封)里.呵呵,应该可以想象得到吧,第一向温度特别重要,不然,电聚焦肯定做不好.2.3.1.3电泳后的凝条处理电聚焦完毕后，用注射器吸满水，套上一个200μl的枪头，当然枪头与注射器间用parafilm封住防漏气。从顶部向下注水使胶条向下滑出。当然，刚开始做的时候肯定不熟，很不爽，有时候你会唱想哭却又哭不出来，呵呵，熟悉了就快了，注射器枪头玻璃管必须为一直线，消息不要把注射器的头搞断了。取一胶条，用双蒸水洗净两端，按酸端到碱端的顺序切成0.5cm的小段，各自浸入含1.3ml抽气后双蒸水的Eppendorf管中过夜，次日用酸度计分别测定各段的pH值，以凝胶长度为横坐标，pH值为纵坐标作图，即为等电点标准曲线。漫漫挤,管子,200卫生枪头,注射器,要成一直线,,要用一手扶着管子,一手拿住200卫生枪头,保证水不从枪头和管子处流出来,注射器顶在胸前把胶条挤出后,放在12%TCA里面,在4度可以保存很久，想什么时候跑SDS-PAGE就什么时候跑。绝招哦,不要随便乱传,嘿嘿！还可以马上看一下,胶条上有蛋白质没有,有的话一下就可以看见了。那些说什么放在平衡液里,-20度的,肯定不行,呵呵！就跟你用考染IEF胶条一样的,带,可能先在12%的TCA里面看不见,不过你再把它放在水里面,泡一会带就出来了。不过在平衡之前,要用ddwater泡30min,而且要换至少5次水,每次用不同的小平皿。注意到下级液磷酸部分的胶条没，是不是有一节约2cm左右，比较突出，没有膨大的部分呀！只是在tca泡的时候磷酸段有一小截变白的速度比较慢，大约3cm左右，呵呵!对要进行第二向SDS-PAGE的胶条则必须用平衡液[2.3%SDS，62.5mmol/LTris-HCL（pH6.8），10%甘油，5%β－巯基乙醇，0.1%溴酚蓝]进行二次平衡，第一次20min，第二次25min。第2次的溶液为新的。一般我是把第2次用过的当成第一次的用。平衡过程中每隔几min轻轻的晃一下小平皿。2.3.2第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）选用DYY-Ⅲ型（北京六一仪器厂生产）电泳槽（规格为200×200×1mm），分离胶浓度为12%，无浓缩胶。待胶聚合后，将电聚焦后已经平衡的胶条平放于浓缩胶顶端（避免胶条拉直），并用1%琼脂糖（电极缓冲液配制）封胶，特别应注意避免胶条与分离胶上沿产生气炮。61厂板子之灌胶：坚决不用凡士林，用透明胶将两端（板子的2边）封住，再用2%琼脂之SDS-PAGE电极液封底，待琼脂凝固后再灌胶，最后用水封胶。over！做之前，一定要保证，1，灌胶不会有任何问题，不能漏，2，不用浓缩胶，只用分离胶。3，分离胶用水封，要保证凝聚好的PAGE胶，为一平的线，凹来凸去的就不要用了。玻璃版能用硅化剂最好不过了。防止从边上漏，我用透明胶（约4cm宽），封住两边，下面还是用2％的琼脂封。灌好电极缓冲液[25mmol/LTris，192mmol/L甘氨酸及0.1%SDS]，按25mA/板胶恒流进行电泳，待溴酚兰离底部1cm时即可停止电泳，一般电泳耗时约4-5h。银染：凝胶于40%甲醇，10%醋酸中固定1h以上或者过夜；用水洗1次,5min;30%乙醇洗2×20min；水洗6×5min；0.02%硫代硫酸钠1min；水洗3×20s；0.2%硝酸银，0.02%甲醛快速的润洗一次,就是过一下的意思,到这个溶液进去,马上又倒掉;0.2%硝酸银，0.02%甲醛20min；水洗3×20s；显色液(3%碳酸钠，0.05%甲醛，0.0005%硫代硫酸钠)快速的润洗一次,就是过一下的意思,到这个溶液进去,马上又倒掉;显色液(3%碳酸钠，0.05%甲醛，0.0005%硫代硫酸钠)显色到你所希望的程度,自己看,背景好,点又多的话就可以了；水洗20秒；0.05%甘氨酸停显。染色理想温度：我去年4,5月时,通常染色都定在中午,12点多;温度最好是20度左右,(这个温度我也没控制的)100%TCA领一瓶TCA500g的那种按分子克隆上的好象是直接加200多ml水就成100%TCA了10%TCA,0.07%2-ME丙酮（100ml）:100%TCA10ml2-ME0.07ml丙酮90ml0.07%2-ME丙酮（100ml）:2-ME0.07ml丙酮100ml0Farrel液(9.5MUrea,2%NP-40,0.4%Am3.5~10,1.6%5~7,5%2-ME)50mlUrea28.5gNP-401mlAmpholine5~72.0ml3.5~100.5ml2-ME2.5ml注意定容！配好后用1.5ml管分装！-70度保存注意这两个溶液配的时候比如配50ml用100ml的烧杯用量筒量50ml水倒如烧杯里面，用记号笔标上刻度，然后把水倒掉，再称尿素小量加水，因为尿素加水后体积会变大，再37度水域锅里溶，然后加其它成分，最后再定到50ml(2002-10-3018:39:37)UKS液(含9.5MUrea,5mMK2CO3,1.25%SDS,0.5%DTT,2%Ampholine(3.5~10),6%TritonX-100)25ml50mlUrea14.25g28.5gK2CO317.25mg34.5mgSDS0.3125g0.625gDTT0.125g0.25g2-MEAmpholine(3.5~10)1.25ml2.5mlTritonX-1001.5ml3ml(0.86ml2枪，4枪)2-ME可适当加一些！注意定容！配好后用1.5ml管分装！-70度保存！双向电泳IPG（summer）一、样品提取：三氯醋酸—丙酮沉淀法（1）在液氮中研磨叶片（2）加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。（3）加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1小时），然后真空干燥沉淀，备用。（4）上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。（5）用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。二、一向电泳（13cm的holder）（1）取大约70-100ng的蛋白与溶胀液混合总体积达到250vl（2）将上述溶液加到holder的两个电极之间。（3）去掉胶条的保护膜，胶面朝下，先将胶条尖端朝胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，最后放下胶条平端，使溶液浸湿整个胶条。（4）在胶条上覆盖适量的覆盖油，盖上盖子。（5）将胶条槽平放于一向仪器上，与水平方向垂直。（6）设置仪器的运行参数：三、胶条的平衡（由一向到二向）（1）将胶条放入10ml平衡缓冲液中（加入10mgDTT）封口，在振荡仪上振荡15分钟。（2）将胶条取出放入10ml新的平衡缓冲液中（加入250mg的碘乙酰胺）封口，在振荡仪上振荡15分钟。（3）用去离子水润洗胶条一秒钟，将胶条的边缘置于滤纸上几分钟，以去除多余的平衡缓冲液。四、二向电泳（1）将平衡好的胶条直接转移到第二向制好的SDS胶上，然后用琼脂糖封顶，准备第二向电泳.（2）设置仪器的运行参数：五、平板胶的染色硝酸银染色：（整个操作在摇床上进行）（1）固定：25ml的冰醋酸，100ml甲醇，125ml去离子水，60分钟。（2）敏化：75ml甲醇，0.5g硫代硫酸钠（使用之前加入），17g醋酸钠，165ml去离子水，30分钟。（3）清洗：用250ml的去离子水清洗3次每次5分钟。（4）银染：0.625g硝酸银，250去离子水，（使用之前配制）20分钟。（5）显色：6.25g碳酸钠，100vl的甲醛（使用之前加入），250ml去离子水。（6）终止：5%的醋酸。（7）照相分析。（8）保存制作干胶。药品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。平衡缓冲液：1.5MTris－Clph8.86.7ml，尿素72.07g，87％的甘油69ml，SDS4g，溴酚蓝少许。溶涨液：尿素12g，CHAPS0.5g，溴酚蓝少许溶于无菌水中，总体积为25ml。使用之前再加入IPG缓冲液0.5vl/100vl，DTT1.5vl/100vl。制作平板胶：分离胶的配制方法：药品/浓度5％7.5％10％12.5%15%丙烯酰胺6.7ml10ml13.3ml16.7ml20ml分离胶缓冲液10ml10ml10ml10ml10ml10×SDS0.4ml0.4ml0.4ml0.4ml0.4ml无菌水22.7ml19.4ml16.1ml12.8ml9.5ml10％过硫酸胺*200vl200vl200vl200vl200vlTEMED*13.3vl13.3vl13.3vl13.3vl13.3vl*在灌胶之前加入药品配制：丙烯酰胺单体储液：丙烯酰胺60g甲叉双丙烯酰胺1.6g溶于无菌水中总体积200ml分离胶缓冲液：Trisbase181.5g溶于750ml无菌水中调PH8.8总体积1000ml10％SDS：SDS5g溶于无菌水中总体积50ml10％的过硫酸胺：0.1g溶于无菌水中总体积1mlSDS电泳缓冲液：Trisbase15.1g甘胺酸72.1gSDS5g溶于无菌水中总体积5000ml封胶溶液：SDS电泳缓冲液100ml琼脂糖0.5g溴酚蓝少许附：蛋白质含量测定的方法（Bradford方法）原理：这一方法基于2考马斯亮蓝G－250有红蓝两种不同的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定。反应化合物在465－595nm处有最大的光吸收值，化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系，因此可检测595nm的光吸收值的大小计算蛋白的含量。溶液：1）Bradford储存液100ml95％乙醇200ml88％磷酸350mgServaG蓝室温下长期保持稳定。2）Bradford工作液425ml双蒸水15ml95％乙醇30ml88％磷酸30mlBradford储存液用滤纸过滤，保存于室温棕色瓶中，可保存数周，但在使用前需要过滤。3）配制1mg/ml牛血清蛋白（BSA）做标准曲线：取样品即可测量。注意事项：1、样品的问题：样品制备是做好2-d的关键，这句话好象有点多余，如果样品中离子浓度过大，根本做不了2d，我开始的时候由于提取方法有问题，结果浪费了很多时间和IPG胶条，真的很心痛呀！另外再说明一点，最好用新鲜的样品提取蛋白质，蛋白点的差异很大，新鲜的样品点多，而我用存放在-80的样品跑出来效果差了很多呀！如果你不确定你的蛋白提的如何，建议你先跑sds-page。检验一下。关于蛋白的提取方法，我还想听听各位的建议。2、上样量的问题，我觉得我跑的这张2D图，上样量还需要调整，可以适当降低，我的ipg胶条是13厘米的上样量在50ng-80ng之间，上样量不合适，丰度低的将会被丰度高的所遮盖，这是最讨厌的问题。3、跑一向的时候大家都差不多，根据公司的说明就可以做了。跑二向的时候我现在一般做恒压，以前做过恒流，没感觉有什么差异，还想请教各位！横流和恒压到底哪个更好一些！4、ipg胶条ph的选择，我做的是植物的花药，一般情况下酸性端点多一点，碱性端较少，我现在选用的是ph3-10的，我觉得很不合适，（不过这个胶条是免费的）因此好多点没能很好的分开，如果胶条的ph小一点，胶条（我希望能达到18cm）可是我们这里做不了，效果应该比这个好很多的！5、从这块胶上，我觉得致命点就是背景深，将影响我下一步的分析。所以银染还需要改进！6、针对不同的蛋白质，分离胶的浓度也是可以调节的，我比较懒，就作过10%，12.5%的，不过觉得都不适合。