培养细胞中RNA检测-NorthernBlot 1.制胶:(1%) 琼脂糖2.5g H2O192.0ml 2.在微波炉中加热煮沸使胶完全溶于水并灭菌。 3.取出胶冷却到60℃,于通风柜中加45ml甲醛,混匀。 4.加20μl溴化乙锭,混匀。 5.令胶液再冷却10分钟。 6.将其倒入四面封好的电泳槽中,加样品梳,约20分钟形成电泳凝胶。 7.加入1×Mops缓冲液于电泳槽,盖满胶表面,但不>1cm。 8.取10~15μgRNA样品,真空离心干燥,再溶于20μl载样缓冲液,加热95℃2分钟,使RNA变性。 9.每孔中20μlRNA点样,同时加一标准物。 10.一般35V电泳,从下午4pm~9:30am。 11.取出胶在紫外灯下观察,将刻度尺放在胶旁照像。成功的电泳在胶上28S(约5kb)18s(约2kb)处可见明显的溴化乙锭带。 12.用500ml10×SSC浸泡洗涤胶2次,每次20分钟,去除甲醛。 13.其它吸印步骤完全与SouthernBlot相同,只是吸印缓冲液为10×SSC。 14.室温下至少吸印12小时。 15.吸印完成后,取出胶与滤膜,表明加样起始部位、膜的方向及标号、用Whatman滤纸包好,80℃真空干燥2小时;如为尼龙膜在紫外灯下照射5分钟。 16.分子杂交:杂交原理与SouthernBlot相同,但所用杂交液及杂交、洗涤温度与之不同。预杂交液制备: 50%甲酰胺 1%SDS 1MNaCl 10%硫酸葡聚糖 17.将滤膜放入塑料袋,加入10ml预杂交液,去除气泡后封袋,在42℃水浴中振荡至少6小时。 18.制备变性鱼精DNA≥100μg/ml,变性同位素标记的探针(加入袋中的终浓度≤10ng/ml或1~4×105dpm/ml)。 19.将此液0.5~1ml以针头注入含预杂交液的塑料袋中,排除气泡,从针眼处重新封死塑料袋,再用玻棒在袋上赶几次,使探针与预杂交液充分混匀,42℃振荡水浴6~42小时。 20.膜的洗涤: a.2×SSC100ml室温中振荡5分钟,共2次。 b.1%SDS的2×SSC200ml60℃振荡30分钟,共2次。 c.0.1×SSC100ml室温振荡30分钟,共2次。 21.膜在室温中自然干燥后,用塑料纸包好即可进行放射自显影过程(同DNA检测)。